背景簡介

通過用逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝構(gòu)建體DNA (pPAM3)和作為片段攜帶在pBR322中的單純皰疹病毒胸苷激酶(TK)基因共轉(zhuǎn)染NIH 3T3 TK-細胞來產(chǎn)生細胞系PA317。除了包裝信號的缺失之外，構(gòu)建體pPAM3還含有幾個突變。這些特征似乎阻止了輔助病毒的產(chǎn)生和包裝功能的轉(zhuǎn)移。用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染或感染導(dǎo)致產(chǎn)生具有雙嗜性宿主范圍的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。它們能夠感染哺乳動物細胞，并已被用于將基因轉(zhuǎn)移到人體中。PA317細胞在長期培養(yǎng)過程中會失去包裝能力。因此，在細胞冷凍保存前，應(yīng)常規(guī)進行選擇。選擇程序包括在含HAT的培養(yǎng)基(0.03mM次黃嘌呤、0.001mM甲氨蝶呤、0.02mM胸苷)中生長5天。為了稀釋殘留的甲氨蝶呤細胞，然后應(yīng)在含HT的培養(yǎng)基(0.03mM次黃嘌呤，0.02mM胸苷)中培養(yǎng)4天。細胞在選擇后至少穩(wěn)定1個月。在冷凍保存前，由HPACC提供的細胞將在非選擇性培養(yǎng)基中生長約2周。因此，在需要重復(fù)前述選擇程序之前，細胞應(yīng)該穩(wěn)定至少2周。

細胞產(chǎn)品信息

PA317小鼠胚胎成纖維細胞培養(yǎng)操作步驟

PA317小鼠胚胎成纖維細胞傳代操作方法

到貨方式：復(fù)蘇細胞/T25瓶運輸

收貨處理

1.收到PA317細胞后，請檢查發(fā)貨培養(yǎng)瓶的狀況，是否有破損、漏液、渾濁等現(xiàn)象。如果有，請立即和我們聯(lián)系;如果沒有，請您用75%酒精消毒細胞瓶外壁，再將其置于37度培養(yǎng)箱靜置4h。細胞密度小于80%時，請換液并讓細胞瓶處于透氣狀態(tài)(培養(yǎng)基不能回收使用)。

2.靜置后觀察細胞狀態(tài)，在顯微鏡下確認細胞生長狀態(tài)時，最好在低倍鏡(4或5X物鏡)下進行，能準確判斷細胞的傳代密度?？醇毎男螒B(tài)請在10X和20X物鏡下，同時給剛收到的細胞拍照，(10×，20×)各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為細胞需要售后時提供收到細胞時細胞狀態(tài)的依據(jù)。拍照反饋給我們。

PA317小鼠胚胎成纖維細胞傳代操作步驟

傳代密度：PA317細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2.加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.將PA317細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

PA317小鼠胚胎成纖維細胞培養(yǎng)注意事項

1.運輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來培養(yǎng)細胞，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。

2.因運輸問題，部分細胞由于溫度變化及劇烈碰撞死亡破碎形成碎片，是正?，F(xiàn)象。請及時和我們聯(lián)系，告知細胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問題解決。

3申請售后時請?zhí)峁┘毎肇洉r及反饋售后當天細胞清晰照片及培養(yǎng)信息，建議客戶在細胞傳代培養(yǎng)后，定期拍照、記錄細胞生長狀態(tài)。

4.所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內(nèi)操作，并請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

5. 細胞在不同實驗室培養(yǎng)由于所使用培養(yǎng)基及血清品牌、個人操作習(xí)慣、培養(yǎng)瓶品牌等諸多培養(yǎng)條件不盡相同，導(dǎo)致細胞培養(yǎng)形態(tài)、生長速度、貼壁情況均可能有所差異，對于此類細胞適應(yīng)環(huán)境生長的行為，不予過度解釋或免費售后。

PA317小鼠胚胎成纖維細胞復(fù)蘇操作步驟

到貨方式：凍存細胞/1ml凍存管運輸

收貨處理

1.干冰運輸?shù)募毎截洠垯z查干冰是否完全揮發(fā)，細胞是否解凍，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系。

2.為保證細胞的高存活率，收到產(chǎn)品后，請立即解凍復(fù)蘇細胞，如若不能復(fù)蘇請立即轉(zhuǎn)入液氮凍存。

PA317小鼠胚胎成纖維細胞復(fù)蘇方法

將含有1 mLPA317細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻

在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。

然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜(或?qū)⒓毎麘乙杭尤? cm皿中，加入約4 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

PA317小鼠胚胎成纖維細胞凍存操作方法

凍存液配方：無血清凍存液，液氮儲存

凍存密度

如果是有要求每管要凍多少細胞，那就用1ml完培重懸后，取部分按平時方法計數(shù)，剩下的細胞按計數(shù)需要的細胞量凍存即可。

如果沒要求，那就按平時，一個皿凍一管。

PA317小鼠胚胎成纖維細胞凍存操作步驟

待PA317細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面 T25 瓶為例

1.收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，加1 mL血清重懸細胞，進行細胞計數(shù)。

2.根據(jù)細胞株數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5x10^6~1x10^7/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。

3.將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

PA317小鼠胚胎成纖維細胞凍存注意事項

凍存細胞轉(zhuǎn)入液氮后及時復(fù)蘇一管檢查細胞凍存活性，若有異常，及時調(diào)整實驗方案