ICLAC國際細胞系身份認證委員會

全稱：國際細胞系身份認證委員會(The International Cell Line Authentication Committee，簡稱ICLAC)

官網(wǎng)：https://iclac.org/

ICLAC簡介

國際細胞系認證委員會 (International Cell Line Authentication Committee, ICLAC)成立于2012年。它的成立是為了幫助學術界發(fā)現(xiàn)更多的錯誤識別/被污染的細胞進而避免在研究實驗中使用;同時進一步提高科學家們的細胞鑒定意識以及推動細胞株鑒定成為科研實驗中的常態(tài)化工作。目前，ICLAC的合作組織或機構有ATCC SDO、CCTCC、ECACC、JCRB等，它發(fā)布的相關指南與建議相當具有權威性。

為什么細胞要進行鑒定

以下為ICLAC細胞鑒定方面的指南與建議：

在開展細胞株相關的研究項目之前：

1)根據(jù)可靠的信息來源選擇所要使用的細胞株

根據(jù)細胞的基因型、表型以及起源等公開信息(包括組織或細胞類型、相關疾病、供體性別和年齡、供體祖籍背景)來選擇最適合進行實驗研究的細胞株。Cellosaurus是查詢細胞株遺傳信息的很好的資源庫：https://www.cellosaurus.org/

2)查詢細胞株是否是已知的錯誤識別/被污染的細胞

由于交叉污染、標簽標記錯誤或其他原因，錯誤識別/被污染的細胞不再與其最初來源的遺傳信息保持一致。交叉污染最初只會導致細胞培養(yǎng)物混合，但是生長更快的污染細胞會逐漸取代原來的、真正的細胞株。ICLAC建立的Register of Misidentified Cell Lines可以幫助查詢：https://iclac.org/databases/cross-contaminations/

3)從可靠、規(guī)范的來源/單位獲取細胞株

細胞株應該從原始來源獲?。阂词菣嗤募毎麕?，要么是細胞最初建系的實驗室或機構。從二次來源獲取的細胞株，如實驗室間交換的細胞，有很大的風險是錯誤識別/被污染的細胞。應當每次要求供應方提供細胞株已做過鑒定的證據(jù)，并檢查供應方是否有信譽。

何時鑒定細胞是否為錯誤識別/被污染的細胞

4)實驗開展之前和論文投稿之前應進行細胞鑒定

當細胞株建系時、細胞株進入新實驗室時、準備新的細胞庫時，都必須進行細胞鑒定。如果將其用于實驗工作，細胞應當在實驗開展之前和實驗結束之后(即文章投稿之前)進行鑒定。細胞株在長時間培養(yǎng)之后、發(fā)生任何遺傳修飾及選擇后以及表型發(fā)生變化時也應當及時進行鑒定。

5)使用基于基因型分析的方法進行細胞鑒定

由于細胞行為和表達模式會隨著細胞傳代和培養(yǎng)條件的變化而變化，因此基于表型分析的方法并不適合進行細胞鑒定。進行細胞鑒定的基因型分析方法可以區(qū)分不同來源的細胞株?；诨蛐头治龅暮线m的細胞鑒定方法包括：

a)STR(Short tandem repeat)分型。這是人源細胞鑒定的金標準、共識方法，包括在實驗室間的結果比較時使用的最小STR基因座集合。STR分型這種方法也逐漸應用到了小鼠細胞的鑒定。

b)SNP(Single nucleotide polymorphism)分型。這種方法并非是基于SNP的細胞鑒定的標準方法。但是，如果細胞通過STR分型被證明正確的，則這種方法可以用于內部測試(例如，作為高通量測序分析的一部分)。已經(jīng)證明，幾組SNP位點能夠有效的對人源細胞進行鑒定。

6)將細胞鑒定結果與數(shù)據(jù)庫比對、以確定是否為錯誤識別/被污染的細胞

檢測錯誤識別/被污染的細胞取決于實驗室間結果的比較，這種比較需要包含很多不同細胞株(包括最有可能引起交叉污染的生長迅速的腫瘤細胞)STR數(shù)據(jù)的專業(yè)細胞數(shù)據(jù)庫。合適的細胞數(shù)據(jù)庫就包括Cellosaurus的STR Similarity Search Tool (CLASTR)：https://www.cellosaurus.org/str-search/

7)使用基于基因型的方法對細胞株進行物種鑒定

如果某種細胞來源于STR分型或SNP分型不適用的物種，那么應該進行對細胞進行物種鑒定。DNA條形碼技術是進行細胞物種鑒定的標準化、共識的方法，這種方法基于對線粒體基因細胞色素c氧化酶亞基1(通常稱為CO1, COI1或COX1)進行測序。物種特異性多重PCR分析也可以快速確認細胞的物種來源。另外，細胞遺傳學分析同樣可以用來進行物種鑒定。

8)檢測微生物污染

所有細胞株應當進行常見微生物污染的檢測，如支原體。還可能進行病毒污染檢測，這具體取決于細胞株類型和研究實驗。

能夠看出，ICLAC關于細胞株鑒定的指南與建議十分詳盡。我們可以提取一些關鍵的信息作為參考：

1.在選擇細胞株之前，應當去ExPASy數(shù)據(jù)庫或ICLAC進行檢索，查看細胞株的相關遺傳信息、查看是否為已知的錯誤識別或被污染的細胞。

2.要從可靠權威的單位購買細胞株，并要求供應方提供相應的細胞株身份證明(即便附帶供應方的鑒定報告，細胞進入實驗室時仍需再次進行鑒定);盡量避免從二次來源的渠道(如實驗室間的交換細胞)獲取細胞株。

3.細胞株不僅要在實驗開始前、論文投稿前進行鑒定;當細胞長時間傳代培養(yǎng)后、發(fā)生任何遺傳修飾及選擇后以及表型發(fā)生變化時也應當及時進行鑒定。

4.使用基于基因型分析的方法進行細胞鑒定。相較SNP分型，更為推薦的是，作為金標準方法的STR分型。目前，STR分型也逐步應用到小鼠細胞鑒定的工作中，相較于其他鼠類細胞，目前針對小鼠細胞鑒定的STR分型技術已經(jīng)相對成熟。

5.進行STR鑒定的同時，須對細胞株進行支原體檢測。

合理的庫存維持流程

科學家Mamie Yu給出了一種細胞系庫存維持建議的流程。每個步驟都需要質量控制，以避免人為錯誤和污染。

在收到一個細胞系(原瓶)后，要對其進行擴增，最好是在一個單獨的超凈臺中，專門用于處理新的細胞系。將細胞系的信息儲存在數(shù)據(jù)庫中，做好記錄備份。對細胞進行支原體和跨物種PCR分析的檢測，并使用STR和SNP指紋圖譜以確認細胞身份。

初始擴增后的細胞被存儲為“主儲備”，以保持細胞系的低傳代來源。然后對這些細胞進行再次擴增，檢測支原體，并作為“工作儲備”儲存起來。取其中一個樣本復蘇擴增，以確定細胞的活力(解凍質量控制)。在使用這些工作儲備前，仍需進行支原體、跨物種污染檢測和SNP基因分型以控制質量。在“工作儲備”超過“主儲備”的(最多)20倍之后，則需要棄用舊的“工作儲備”，從“主儲備”擴增產(chǎn)生新的“工作儲備”。

同時，在任何階段的質量控制失敗都需要重新檢測，因為可能會出現(xiàn)假陽性或樣品混淆的情況。在初始擴增后，所有后續(xù)的重新擴增或常規(guī)質量控制，都要使用SNP平臺進行監(jiān)測。將細胞系注釋與數(shù)據(jù)庫中的STR/SNP圖譜聯(lián)系起來，為將任何基于細胞的數(shù)據(jù)與原生細胞系聯(lián)系起來提供了基礎，從而有利于數(shù)據(jù)整合和比較。

防止細胞交叉污染的建議

盡管ICLAC提出的細胞株鑒定指南和建議十分詳盡，但仍可提取一些關鍵信息：

1. 開始實驗前：需要在權威數(shù)據(jù)庫(如ICLAC)進行檢索，以查看細胞株相關遺傳信息、了解是否為已知的錯誤識別或污染。

2. 獲取細胞株：需要從可靠權威的單位購買，并要求供應方提供相應的細胞株身份證明，盡量避免從二手渠道(如實驗室間的交換)獲取細胞株。

3. 細胞株鑒定：在獲取細胞株保藏前、實驗開始前、論文投稿前、長時間傳代后、發(fā)生遺傳修飾/表型變化后均應當及時進行鑒定。

4. 細胞培養(yǎng)準備工作：根據(jù)已了解的細胞特性，提前準備好合適的培養(yǎng)基和血清等，沿用此前的培養(yǎng)條件進行擴增。

5. 避免交叉感染：

(1) 避免同時處理生長快和生長慢的細胞

(2) 在接觸細胞后，不要將移液管放回培養(yǎng)基或試劑瓶

(3) 避免氣溶膠在敞開的培養(yǎng)物間傳遞

(4) 避免使用未塞棉花的移液管

(5) 避免在凍存、復蘇和培養(yǎng)時錯誤標記

(6) 必要時進行細胞株鑒定和微生物(支原體、細菌、真菌等)污染檢測

(7) 定時觀察培養(yǎng)物狀態(tài)、保證檢測的真實有效

(8) 盡量避免共用培養(yǎng)基和(或)移液管

6. 細胞鑒定方法：可使用STR或SNP分型。

參考文獻

1. http://www.jsdna.org/cell

2. http://www.jsdna.org/mobile/information/xuz

3. Bairoch A. The Cellosaurus, a knowledge resource of the cell line. J Biomol Tech 2018 29(2): 25-38. doi: 10.7171/jbt.18-2902-002.

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