不知道小伙伴在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，有沒(méi)有遇到細(xì)胞消化過(guò)后，仍有些細(xì)胞分散不開(kāi)，吹又不敢吹，棄又棄不凈，結(jié)果聚團(tuán)細(xì)胞像滾雪球一樣越聚越大、越聚越多情況，細(xì)胞聚團(tuán)原因是什么，是污染還是操作失誤，遇到細(xì)胞抱團(tuán)如何處理呢?

我們知道當(dāng)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行單懸浮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，樣本中出現(xiàn)細(xì)胞丟失的情況并不少見(jiàn)。當(dāng)細(xì)胞破裂時(shí)，它們會(huì)釋放DNA和碎片，導(dǎo)致細(xì)胞聚集成大團(tuán)塊，使其難以擴(kuò)張。細(xì)胞聚團(tuán)既可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，也可引起細(xì)胞死亡。隨著更多的細(xì)胞死亡并釋放碎片，問(wèn)題將繼續(xù)惡化，所以盡可能快地處理或避免細(xì)胞聚團(tuán)將有利于實(shí)驗(yàn)的后續(xù)結(jié)果。

細(xì)胞聚團(tuán)的原因

首先要明確一點(diǎn)，常規(guī)的“抱團(tuán)”是指貼壁細(xì)胞被消化后懸浮狀態(tài)下的聚集情況。細(xì)胞在貼壁生長(zhǎng)時(shí)，聚集在一起是正?，F(xiàn)象。當(dāng)周?chē)?xì)胞寥寥無(wú)幾，而這一團(tuán)已經(jīng)疊層生長(zhǎng)，這就是在懸浮狀態(tài)就已經(jīng)聚團(tuán)的細(xì)胞再貼壁導(dǎo)致的。相同條件下，培養(yǎng)的癌細(xì)胞對(duì)密度依賴(lài)性的生長(zhǎng)抑制敏感性降低，所以即使在形成單層后，也不會(huì)停止生長(zhǎng)，而是相互堆積形成多層生長(zhǎng)的聚集體。

防止細(xì)胞聚團(tuán)的最佳方法之一是了解是什么導(dǎo)致了細(xì)胞聚集，并采取預(yù)防措施避免這些事件的發(fā)生。培養(yǎng)物中細(xì)胞可能聚集的一些原因包括：

1.過(guò)度消化

某些用于組織分解的酶，如胰蛋白酶，如果過(guò)量使用會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)塊。很多人覺(jué)得細(xì)胞多多益善，經(jīng)常將貼壁細(xì)胞養(yǎng)到疊層、或密集程度特別高時(shí)才進(jìn)行傳代，如果一直這樣，不僅會(huì)縮短傳代時(shí)間，導(dǎo)致操作密集;同時(shí)細(xì)胞的老化會(huì)更加嚴(yán)重。另外，細(xì)胞死亡時(shí)釋放DNA，會(huì)“抓住”其他細(xì)胞，形成黏性的細(xì)胞團(tuán)，若不及時(shí)處理，整體細(xì)胞狀態(tài)會(huì)惡性循環(huán)。

2.環(huán)境壓力

物理壓力和反復(fù)的溫度變化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致細(xì)胞的“粘性”的DNA分子將相鄰的細(xì)胞連接在一起

3.組織分解

在制備單細(xì)胞懸浮液時(shí)，使用酶、機(jī)械或化學(xué)分解策略可使細(xì)胞破裂，從而導(dǎo)致碎片的聚團(tuán)。

4.過(guò)度生長(zhǎng)

當(dāng)細(xì)胞在其培養(yǎng)基中密度過(guò)大的時(shí)候，細(xì)胞將開(kāi)始溶解并釋放碎片，碎片中的粘性因子會(huì)將細(xì)胞聚集到一起

5.污染

某些細(xì)菌和真菌病原體導(dǎo)致細(xì)胞溶解;結(jié)塊通常是細(xì)胞培養(yǎng)物被污染的跡象。部分細(xì)胞被污染后會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞聚團(tuán)，這和操作有很大關(guān)系，比如：傳代鋪板時(shí)，是否進(jìn)行了活細(xì)胞計(jì)數(shù)并及時(shí)調(diào)整濃度;終止消化時(shí)間點(diǎn)是否準(zhǔn)確;混勻是否過(guò)于輕柔或粗暴;胰酶是否濃度過(guò)高;離心收集時(shí)，加速度是否過(guò)大等，都會(huì)直接影響子代細(xì)胞狀態(tài)。

6.雖然其中一些是由于實(shí)驗(yàn)錯(cuò)誤而發(fā)生的，但實(shí)際也有部分的細(xì)胞具有天生的聚團(tuán)現(xiàn)象，比如大部分的半懸浮細(xì)胞，BV-2 ,NCI-H716等等，半懸浮細(xì)胞一般在在整體匯合度70%左右就要進(jìn)行傳代操作了，這樣可以降低細(xì)胞聚成大團(tuán)塊的風(fēng)險(xiǎn)。

為什么細(xì)胞聚團(tuán)是個(gè)問(wèn)題

單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基的目標(biāo)是為靶細(xì)胞提供盡可能多的生長(zhǎng)資源。這包括充足的生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)和充足的繁殖空間。當(dāng)細(xì)胞聚集在一起時(shí)，它們會(huì)相互限制，降低細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)吞吐量，最終影響生長(zhǎng)結(jié)果。

細(xì)胞聚團(tuán)也會(huì)導(dǎo)致靶細(xì)胞的回收率降低，并且會(huì)干擾標(biāo)記，這也是懸浮細(xì)胞標(biāo)記的成功率不高的原因，某些細(xì)胞分析方法，如流式細(xì)胞術(shù)，需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆蛛x。在流式細(xì)胞術(shù)中，大量細(xì)胞以快速的液流通過(guò)機(jī)器。這臺(tái)被稱(chēng)為細(xì)胞儀的機(jī)器檢測(cè)不同細(xì)胞之間物理特性的差異，并使用熒光燈對(duì)它們進(jìn)行相應(yīng)的標(biāo)記。如果細(xì)胞通過(guò)試管時(shí)聚集在一起，細(xì)胞儀將很難準(zhǔn)確測(cè)量它們的特性。這會(huì)導(dǎo)致它們被不正確地分類(lèi)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響。

聚團(tuán)細(xì)胞狀態(tài)都不好嗎

若細(xì)胞輪廓清晰，胞體通透，呈串狀均勻聚集，證明其狀態(tài)較好，正在分裂。但是大多數(shù)情況下，聚團(tuán)細(xì)胞都是輪廓模糊，細(xì)胞透光性差，甚至出現(xiàn)合胞體，同時(shí)伴有細(xì)胞碎片，這證明細(xì)胞已經(jīng)衰老或者產(chǎn)生病變，狀態(tài)不佳。

如何避免聚團(tuán)細(xì)胞的生成

首先確認(rèn)當(dāng)前細(xì)胞生長(zhǎng)密度及狀態(tài)，80%左右的生長(zhǎng)密度即可進(jìn)行傳代，此時(shí)細(xì)胞狀態(tài)較好，且用于傳代的數(shù)量也足夠。

傳代操作前，使用緩沖液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)且全面地潤(rùn)洗，清除死亡的細(xì)胞團(tuán)和部分堆疊雜質(zhì)(在選擇適當(dāng)胰酶濃度時(shí)，對(duì)于不同代數(shù)的不同細(xì)胞系需進(jìn)行一定的調(diào)整，如：部分貼壁牢固的細(xì)胞應(yīng)將胰酶分裝后，進(jìn)行預(yù)熱處理;細(xì)胞密度過(guò)高時(shí)，應(yīng)該向胰酶中加入少量緩沖液，緩慢均勻地消化細(xì)胞等。對(duì)于貼壁格外牢固的細(xì)胞，可以嘗試多次分批進(jìn)行消化，最大限度保證細(xì)胞狀態(tài))。

在消化過(guò)程中，需均勻慢速晃動(dòng)培養(yǎng)器皿，以免局部胰酶濃度過(guò)高而影響傳代。切勿用力搖動(dòng)，導(dǎo)致邊緣松動(dòng)的大片細(xì)胞直接脫落，從而增加細(xì)胞成團(tuán)幾率。

培養(yǎng)器皿的選擇也需注意，部分實(shí)驗(yàn)室會(huì)使用玻璃培養(yǎng)瓶，因細(xì)胞貼壁在玻璃底更容易分離。同時(shí)玻璃材質(zhì)的親水性和塑料有區(qū)別，而且玻璃細(xì)胞培養(yǎng)瓶都是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部處理，可能會(huì)有清潔殘留，在一定程度上抑制細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)，并且更容易消化，細(xì)胞之間的連接比貼壁還要緊密，聚團(tuán)幾率很大。

另外，避免傳代過(guò)程中匯合度較大，本身1:3甚至1:4都可以正常培養(yǎng)的細(xì)胞被1:2傳代，會(huì)導(dǎo)致母代細(xì)胞濃度過(guò)高，在分化過(guò)程中出現(xiàn)堆疊現(xiàn)象，所以在每次細(xì)胞傳代前要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

適當(dāng)?shù)奶幚砗驮O(shè)備使用，也可以減少結(jié)塊。如果使用離心機(jī)分離或混合樣品，將其設(shè)置為正確的速度可以減少聚團(tuán)，通常情況下，較快的速度可以離心散細(xì)胞，但在高速下也必須考慮細(xì)胞的脆弱性，所以適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)離心的時(shí)間也不失為一種穩(wěn)靠的離心散懸浮聚團(tuán)細(xì)胞的方法。

還有一些方法可以分離細(xì)胞，這些細(xì)胞聚集在一起，不會(huì)造成過(guò)度的傷害。某些叫做螯合劑的化學(xué)物質(zhì)與正電荷離子有親和力。根據(jù)細(xì)胞聚團(tuán)的性質(zhì)，可以添加螯合劑來(lái)溶解它們之間的粘連，而不會(huì)傷害細(xì)胞。乙二胺四乙酸(EDTA)是一種螯合劑，常用于溶解鈣粘連。

另一種細(xì)胞清除方法是氚化。氚化過(guò)程涉及到溫和、重復(fù)的吸管，以打破細(xì)胞間的弱粘。

已經(jīng)聚團(tuán)的細(xì)胞，只能棄掉嗎

如果預(yù)實(shí)驗(yàn)比較緊急，或者細(xì)胞株較為珍貴，也可以在復(fù)蘇新細(xì)胞的同時(shí)，進(jìn)行聚團(tuán)細(xì)胞“拯救”。

可以將帶有聚團(tuán)細(xì)胞的樣品低密度連續(xù)傳代，約三代過(guò)后，逐漸分散為獨(dú)立個(gè)體，再通過(guò)監(jiān)測(cè)細(xì)胞活力狀態(tài)，判斷是否可用來(lái)進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。若肉眼可見(jiàn)，即可直接通過(guò)清洗和吸出，或是在消化后將懸起的細(xì)胞樣品靜置數(shù)十秒以沉淀團(tuán)塊。對(duì)于死細(xì)胞聚團(tuán)，可以在細(xì)胞液中適量加入DNase以斷裂DNA。