293T人胚腎細(xì)胞培養(yǎng)常見問題

1.293T細(xì)胞形態(tài)是什么樣的?

293t細(xì)胞形態(tài)呈上皮細(xì)胞樣，貼壁生長。

2.到貨的293T細(xì)胞脫落，如何處理?

293T細(xì)胞因?yàn)橘N壁松散，若購買常溫細(xì)胞，收貨時(shí)有可能大部分細(xì)胞脫離培養(yǎng)瓶壁，顯微鏡下找不到細(xì)胞，只能看到肉眼可見的細(xì)胞團(tuán)，是正?，F(xiàn)象。

收到細(xì)胞后請先置于培養(yǎng)箱中穩(wěn)定4-6h后再進(jìn)行下一步處理，不建議放置培養(yǎng)箱過夜后處理。

處理步驟

1.將培養(yǎng)瓶內(nèi)所有培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌離心管，1000rpm離心4min收集細(xì)胞；

2.去掉上清，用PBS重懸細(xì)胞(以手搖離心管的方式重懸，不要用移液槍吹)，將細(xì)胞收集到一個(gè)離心管中，再次1000rpm離心4min；

3.去掉上清，加入1mL左右0.25%胰酶重懸細(xì)胞(還是以手搖離心管的方式混勻，不要吹細(xì)胞), 放入培養(yǎng)箱消化2min；

4.消化2min后，加入5mL完全培養(yǎng)基混勻終止消化，用移液槍輕輕吹打細(xì)胞懸液，使細(xì)胞團(tuán)分散，1200rpm離心3min；

5.去掉上清，加入6mL左右細(xì)胞相應(yīng)的完全培養(yǎng)基混勻，視細(xì)胞量決定是1:2傳代還是1:3傳代(由于細(xì)胞運(yùn)輸有損傷，首次傳代建議比平時(shí)養(yǎng)密度稍高)；

6.顯微鏡下觀察細(xì)胞是否有分散成單顆現(xiàn)象，若有明顯很大的細(xì)胞團(tuán)需要重復(fù)上述步驟二次消化;

7.第二天及時(shí)觀察細(xì)胞貼壁情況，若貼壁細(xì)胞量過多，造成細(xì)胞堆積，貼壁24h后再次傳代分瓶，若密度正常則繼續(xù)生長，不建議換液貼壁48h后換液去掉不能貼壁的細(xì)胞。

3.293T人胚腎細(xì)胞傳代后聚團(tuán)嚴(yán)重?

原因分析

a.胰酶消化操作不當(dāng)導(dǎo)致細(xì)胞聚團(tuán)。消化過度或吹打過猛導(dǎo)致細(xì)胞受傷嚴(yán)重，破損的細(xì)胞碎片容易粘連聚團(tuán)。

b.消化時(shí)293T細(xì)胞融合率太高，成片脫落，將不容易被吹散，容易聚團(tuán)。

c.鑒于293T細(xì)胞貼壁疏松，普通0.25%胰酶消化時(shí)間控制10s-40s(不同胰酶牌子消化時(shí)間不同);吹打動(dòng)作輕柔，充分分散;細(xì)胞融合率達(dá)到80%-90%即可傳代，不可長的太滿。

d.細(xì)胞培養(yǎng)基中存在的成分：一些細(xì)胞培養(yǎng)基的成分可能促進(jìn)細(xì)胞的聚集，例如含有過多的膠原蛋白或其他黏附蛋白。

e. 細(xì)胞質(zhì)粘附不良：有些細(xì)胞可能由于細(xì)胞表面蛋白或黏附分子的缺失導(dǎo)致粘附能力下降，從而容易聚集在一起。

f 培養(yǎng)條件不當(dāng)：細(xì)胞培養(yǎng)過程中的pH、溫度、氣體條件等因素如果不適當(dāng)可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞聚集。

g. 感染或污染：細(xì)胞培養(yǎng)過程中的感染或污染可能導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生異常反應(yīng)，包括聚集在一起形成團(tuán)塊。

4.293T人胚腎細(xì)胞換了血清批次后聚團(tuán)嚴(yán)重?

原因分析

血清批次間存在差異。293T細(xì)胞本身有聚團(tuán)生長特性，但嚴(yán)重聚團(tuán)可能是由于受到血清里的某些因子刺激。

先用血清試用裝，試用效果好，可購買和血清試用裝批次相同的正裝，有效避免批間差對細(xì)胞的影響。

5.293T人胚腎細(xì)胞轉(zhuǎn)染病毒后凋亡嚴(yán)重？

在排查了方法步驟和轉(zhuǎn)染試劑，依然沒有改善的情況下，可排查一下轉(zhuǎn)染前的營養(yǎng)體系，尤其是血清批間差帶來的影響。前期培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)正常，其實(shí)細(xì)胞形態(tài)學(xué)只是鑒別細(xì)胞是否健康的一個(gè)外在指標(biāo)，還要結(jié)合細(xì)胞其它指標(biāo)對細(xì)胞健康進(jìn)行評定(比如倍增時(shí)間，存活率)。

通過更換血清批次，再進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)并觀察轉(zhuǎn)染后的效果，比較分析出原因。

6.293T人胚腎細(xì)胞培養(yǎng)要點(diǎn)

293T人胚腎細(xì)胞貼壁性較差，容易飄起來，37℃靜置可重新貼壁。換液時(shí)注意不要用力搖晃培養(yǎng)瓶，否則有可能會(huì)把細(xì)胞搖下來。

293T人胚腎細(xì)胞容易消化，消化下來的細(xì)胞容易成團(tuán)，要吹打吹散。否則傳代后細(xì)胞會(huì)成團(tuán)生長，不均勻，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

當(dāng)293T人胚腎細(xì)胞生長至匯合率達(dá)到80~90%需要對細(xì)胞進(jìn)行傳代操作，以擴(kuò)大細(xì)胞數(shù)量，維持細(xì)胞良好的生長狀態(tài)。

細(xì)胞貼壁松散，操作時(shí)應(yīng)輕拿輕放;PBS潤洗時(shí)動(dòng)作應(yīng)緩慢，避免沖走細(xì)胞;

細(xì)胞傳代第二天可能有輕微聚團(tuán)現(xiàn)象，再長一天能長開，不建議傳代第二天換液，以免損失細(xì)胞。

隨著傳代的次數(shù)增加，293T細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)生長狀態(tài)下降，出現(xiàn)突變等情況。所以要在細(xì)胞購進(jìn)時(shí)就進(jìn)行大量凍存，以保證實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和持續(xù)性。

7.293T人胚腎細(xì)胞特點(diǎn)

a.細(xì)胞貼壁能力比較弱：293T細(xì)胞是貼壁細(xì)胞，但其貼壁能力比較弱，容易出現(xiàn)明顯的成片脫落現(xiàn)象。比如：運(yùn)輸?shù)蜏丶罢鹗?、在室溫條件下靜置時(shí)間過長、添加的培養(yǎng)基或其他試劑溫度過低、培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞密度過高、細(xì)胞聚集時(shí)未吹散、加液吹打時(shí)觸碰了細(xì)胞表面等。

若脫落現(xiàn)象不嚴(yán)重應(yīng)將細(xì)胞盡快放回培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，若出現(xiàn)大片脫落的現(xiàn)象需要收集細(xì)胞重新消化吹散再接種。

b.細(xì)胞本身偏嗜酸性，培養(yǎng)基消耗較快；293T細(xì)胞在略偏酸性的環(huán)境下生長狀態(tài)更好，在培養(yǎng)過程中需要時(shí)刻注意培養(yǎng)基的pH值。在細(xì)胞密度達(dá)到70%以上時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)基的消耗速度較快，需要時(shí)刻觀察并及時(shí)換液。

c.細(xì)胞生長時(shí)聚集成島：293T細(xì)胞生長時(shí)呈島狀聚集生長，會(huì)逐步向外擴(kuò)散直到完全融合。

d.細(xì)胞聚集成團(tuán)之后很難再吹散：293T細(xì)胞傳代過程中一定要注意吹散細(xì)胞，同時(shí)接種的密度不可過高。密度過高容易使細(xì)胞抱團(tuán)，導(dǎo)致難以再次吹散，會(huì)在培養(yǎng)器皿中形成類似于球狀的聚集體貼壁生長。導(dǎo)致即使培養(yǎng)條件合適細(xì)胞也難以生長。