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THP-1人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞培養(yǎng)常見問題

1.THP-1人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞的特點(diǎn)？

a.THP-1細(xì)胞為懸浮生長(zhǎng)，單顆生長(zhǎng)，少部分松散成團(tuán)。

b.THP-1細(xì)胞喜歡酸性環(huán)境：在偏酸性環(huán)境中，THP-1生長(zhǎng)更快，所以當(dāng)培養(yǎng)基稍微變黃(呈橘紅色)時(shí)，是適合細(xì)胞生長(zhǎng)的，此時(shí)補(bǔ)液或半換液即可。

c.THP-1細(xì)胞有密度依賴性：THP-1細(xì)胞密度低時(shí)，生長(zhǎng)較慢，培養(yǎng)密度維持在50萬-100萬細(xì)胞/毫升為宜;超過200萬/毫升則需要傳代。

d.THP-1細(xì)胞對(duì)血清要求高：血清質(zhì)量差異可能引起細(xì)胞狀態(tài)變化，建議選用高質(zhì)量的胎牛血清。選擇品質(zhì)好的血清更有利于THP-1細(xì)胞生長(zhǎng)。

e.THP-1細(xì)胞易受凍存影響，因此應(yīng)選擇細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)凍存，并適量增加凍存的細(xì)胞量，以提高復(fù)蘇存活率。

f.THP-1細(xì)胞復(fù)蘇后通常需要3-5天的時(shí)間恢復(fù)狀態(tài)，建議復(fù)蘇后48小時(shí)不要接觸細(xì)胞，晃動(dòng)培養(yǎng)瓶/皿，以免影響細(xì)胞狀態(tài)。

2.THP-1人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞凍存過后復(fù)蘇困難怎么辦?

a.凍存前細(xì)胞狀態(tài)較好, 凍存總量不低于1*106/支.

b.復(fù)蘇后細(xì)胞接種密度建議3*106/ml。

c.如有細(xì)胞碎片，待細(xì)胞密度增大后通過低速離心去除。

3.THP-1細(xì)胞收貨時(shí)出現(xiàn)偽足，或是碎片較多怎么辦?

受到運(yùn)輸影響，懸浮細(xì)胞會(huì)短暫性出現(xiàn)形態(tài)改變的現(xiàn)象，如偽足等。通過傳代培養(yǎng)，1周左右可以恢復(fù)正常。一些THP-1細(xì)胞在運(yùn)輸途中死亡而產(chǎn)生碎片，通過傳代離心可以去除。

處理方法

收集THP-1細(xì)胞，1000RPM條件下離心3-5min分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2ml培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液重新分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4.THP-1人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)胞發(fā)生貼壁怎么處理?

THP-1細(xì)胞培養(yǎng)過程中出現(xiàn)少量細(xì)胞貼壁屬于正常情況，不需要擔(dān)心?？梢暂p吹收集細(xì)胞或者丟棄貼壁部分細(xì)胞。

處理方法

只需將THP-1細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新瓶中即可。但如果當(dāng)貼壁細(xì)胞的比例高于20%，說明細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境有異常，這時(shí)候就需要排查培養(yǎng)箱設(shè)置、培養(yǎng)基成分，以及培養(yǎng)器皿是否異常。

5.THP-1人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)胞發(fā)生聚團(tuán)怎么辦?

THP-1細(xì)胞培養(yǎng)過程中出現(xiàn)少量細(xì)胞聚團(tuán)，呈葡萄串狀，屬于正?，F(xiàn)象，特別是THP-1細(xì)胞密度較低時(shí)，易出現(xiàn)這種情況。

處理方法

可以更換血清品牌或增大血清比例(不超過20%)有助于解決聚團(tuán)問題。不建議將聚團(tuán)的細(xì)胞吹散，等待密度高時(shí)，會(huì)自己分散開。

6.THP-1人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞培養(yǎng)基里一定要加β-巰基乙醇嗎?

β-巰基乙醇是一種常用的培養(yǎng)補(bǔ)充劑，有抗氧化的作用，可減少氧化應(yīng)激對(duì)THP-1細(xì)胞的影響。當(dāng)細(xì)胞密度過大但需要維持時(shí)，可適當(dāng)增加巰基乙醇的比例(不超過標(biāo)準(zhǔn)量的1.5倍)。

7.THP-1人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞鏡下觀察時(shí)，難以聚焦或估算密度怎么辦?

THP-1細(xì)胞形態(tài)特征懸浮生長(zhǎng)，懸浮細(xì)胞會(huì)隨著液體流動(dòng)，不容易聚焦，靜置5-10分鐘使細(xì)胞沉底，之后再輕輕放上顯微鏡觀察，將有助于聚焦和估算細(xì)胞密度。

8.THP-1人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)

a.THP-1屬于懸浮細(xì)胞，顯微鏡下可見細(xì)胞呈圓形，透明度高，背景干凈，碎片很少，說明細(xì)胞狀態(tài)很好。

b.THP-1常用RPMI 1640培養(yǎng)基，含10%胎牛血清，在37度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。特別注意的是THP-1喜歡酸性環(huán)境，對(duì)培養(yǎng)基pH值的變化很敏感，通常培養(yǎng)基顏色呈橘紅色時(shí)細(xì)胞最適宜生長(zhǎng)。所以盡量使用相同Ph的1640。

c.THP-1細(xì)胞有密度依賴性，低密度時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)慢，建議細(xì)胞量維持在每毫升50-100萬為宜，超過10^6/ml即可傳代，傳代比例采用1:3~1:4，換液不需要太頻繁，正常2~3天換1次液即可。

注意細(xì)胞的密度一定要高，介于5×105—— 106/ML之間，增值的快。細(xì)胞數(shù)量太少，不適合THP-1生長(zhǎng)，一般狀態(tài)不好的THP-1在培養(yǎng)了3天后數(shù)量仍然不多，繼續(xù)培養(yǎng)一天或者兩天，培養(yǎng)基嚴(yán)重泛黃，細(xì)胞數(shù)會(huì)增加。

d.傳代后切忌常移出培養(yǎng)箱觀察，否則會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)，狀態(tài)變差，一般首先表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)顆粒變多。一般THP-1 生長(zhǎng)相當(dāng)快，對(duì)于狀態(tài)已經(jīng)不好的情況，建議傳代后3～4天再觀察，一般4天時(shí)間培養(yǎng)基已明顯泛黃，細(xì)胞數(shù)量巨增

e.THP-1細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)可能會(huì)有部分細(xì)胞聚團(tuán)生長(zhǎng)，若細(xì)胞團(tuán)塊過大過多，應(yīng)當(dāng)輕輕將其吹散。

9.THP-1細(xì)胞狀態(tài)不太好，大小不均勻，有皺縮

THP-1細(xì)胞就是大大小小的，運(yùn)輸導(dǎo)致的個(gè)別死細(xì)胞也是正常會(huì)有的，這個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)的很快，細(xì)胞量多了低速離心就可以去掉死細(xì)胞。養(yǎng)養(yǎng)就好了。

10.THP-1復(fù)蘇之后增值特別慢，還有一個(gè)就是PAM誘導(dǎo)了之后不貼壁

THP-1細(xì)胞加PAM是能貼壁的，但是得等細(xì)胞狀態(tài)好的時(shí)候，才能貼

第一個(gè)，細(xì)胞先調(diào)整好狀態(tài)才能貼壁，第二個(gè)，在誘導(dǎo)貼壁時(shí)注意細(xì)胞數(shù)量，不能太多因?yàn)橐蜃訚舛炔粔蛞操N不上，太少了貼壁不上，觀察不到后續(xù)細(xì)胞，建議，24孔板做10000個(gè)細(xì)胞，然后5000個(gè) 15000個(gè)，20000個(gè)都做三個(gè)重復(fù)，然后每孔500微培養(yǎng)基。