CAL27細(xì)胞背景簡介

CAL-27細(xì)胞是1982年由J.Gioanni(法國尼斯塞德克斯安托萬·拉卡薩涅中心)從一位56歲的白人男性舌中部病變患者治療前的組織中分離出來的上皮細(xì)胞，是一種非整倍體細(xì)胞，染色體模式數(shù)43。CAL-27細(xì)胞是上皮性的多邊形細(xì)胞，胞質(zhì)高度顆粒狀，細(xì)胞角蛋白強(qiáng)陽性。CAL-27細(xì)胞細(xì)胞在半固態(tài)培養(yǎng)基中生長不好。CAL-27細(xì)胞在VP16(依托泊苷)、CCNU(1-[2-氯乙基]-3-環(huán)己基-1-亞硝基脲)、VM26(替尼泊苷)、ADM(阿霉素)、CPA(環(huán)磷酰胺)和MTX(甲氨蝶呤)存在下，觀察到胸腺嘧啶摻入的顯著抑制。CAL 27細(xì)胞對VDS(硫酸長春地辛)、CDP(順式鉑)或ACTD(放線菌素D)的治療有抗性。1993年12月提交給ATCC的培養(yǎng)物被發(fā)現(xiàn)被支原體污染，通過用BM Cycline治療21天治愈后代。CAL-27細(xì)胞可以用于3D細(xì)胞培養(yǎng)和癌癥研究。

細(xì)胞對硫酸長春地辛(VDS)、順鉑(CDP)和放線菌素D(ACDD)等藥物有耐藥性，是口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)研究領(lǐng)域最常用的細(xì)胞系之一。然而有研究發(fā)現(xiàn)，通過腫瘤形成試驗、HE染色和免疫組化實驗證明CAL-27異種移植物在體內(nèi)生長緩慢，腫瘤表面和更深區(qū)域均形成囊泡，其生長模式更偏向口腔腺鱗癌。

Cal-27細(xì)胞具有高度顆粒狀的細(xì)胞質(zhì)，在半固體培養(yǎng)基中無法正常生長。該細(xì)胞是個合適的轉(zhuǎn)染宿主，染色體模式為非整倍體，染色體數(shù)為43。在裸鼠體內(nèi)可成瘤，皮下接種2×10^6個細(xì)胞，6周內(nèi)可發(fā)展為實體瘤。

CAL-27細(xì)胞形態(tài)特征

Cal-27細(xì)胞呈上皮細(xì)胞樣，貼壁生長，細(xì)胞具有高度顆粒狀的細(xì)胞質(zhì)常用在口腔鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)研究上。

CAL-27人舌鱗癌細(xì)胞產(chǎn)品信息

細(xì)胞名稱：CAL-27人舌鱗癌細(xì)胞

細(xì)胞別稱：Cal-27; CAL 27; Cal 27; CAL27; Cal27; Centre Antoine Lacassagne-27;人舌鱗癌細(xì)胞

種屬來源：人

年齡性別：男;56歲

組織來源：舌

生長特性：貼壁生長

細(xì)胞形態(tài)：上皮細(xì)胞樣

STR位點信息：Amelogenin：X;CSF1PO：10，12;D13S317：10，11;D16S539：11，12;D18S51：13;D19S433：14，15.2;D21S11：28，29;D2S1338：23，24;D3S1358：16;D5S818：11，12;D7S820：10;D8S1179：13，15;FGA：21，25;TH01：6，9.3;TPOX：8;vWA：14，17;

保藏機(jī)構(gòu)：ATCC; CRL-2095 DSMZ; ACC-446;中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心

培養(yǎng)基：90%DMEM+10%FBS+P/S

培養(yǎng)條件：氣相：95%空氣+5%二氧化碳;溫度：37℃

凍存條件：無血清凍存液，液氮儲存

染色體：43，異倍體

倍增時間：~20-45 hours

致瘤性：Yes, solid tumors developed within 6 weeks in nude mice inoculated with 2×10^6 cells subcutaneously.

CAL-27細(xì)胞培養(yǎng)操作方法

細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件

實驗室條件

1.無菌環(huán)境：無菌室包括更衣室，緩沖間，風(fēng)淋間，操作間

2.儀器設(shè)備：超凈工作臺-操作平臺、CO2培養(yǎng)箱-細(xì)胞生長的環(huán)境、倒置顯微鏡-觀察細(xì)胞、離心機(jī)-離心收集細(xì)胞、冰箱-放置培養(yǎng)基等試劑、水浴鍋-復(fù)蘇細(xì)胞、真空泵-收集廢液、滅菌鍋-滅菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-凍存細(xì)胞、純水儀-制備一級水

3.器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭(白色0-10ul;黃色20-200ul;藍(lán)色100-1000ul)、濾器，吸管，多孔培養(yǎng)皿、6cm皿、10cm皿，培養(yǎng)瓶等。

4.試劑：DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、FBS胎牛血清、雙抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)、pbs

操作者工作范疇

1.無菌操作：洗手，戴手套，穿實驗服，常噴75%酒精

CAL-27人舌鱗癌細(xì)胞復(fù)蘇方法

1)準(zhǔn)備：紫外線照臺30min，提前打開水浴鍋設(shè)置37℃，培養(yǎng)基臨用前放水浴箱里溫育20分鐘(或者放在超凈工作臺常溫放30min)。在操作臺上擺放好物品，左邊放完全培養(yǎng)液，1mL槍頭(已滅菌)，培養(yǎng)皿，右上角放廢液缸，1mL移液槍，3mL巴氏管。檢查離心機(jī)，廢液泵。

2)待水浴鍋溫度達(dá)到37℃時，戴上手套和護(hù)目鏡，從-196℃液氮罐中取出凍存管，將含有1mLCAL-27細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，同時不斷輕輕搖動凍存管，盡量保證凍存管內(nèi)細(xì)胞1min內(nèi)融化，加4mL培養(yǎng)基混合均勻，移入離心機(jī)中100rpm離心3min，以75%酒精噴凍存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。

3)用3mL巴氏管取5mL新鮮培養(yǎng)基到一個新的6cm培養(yǎng)皿中，(若離心后細(xì)胞量較多，可取12mL新鮮培養(yǎng)基到一個新的10cm培養(yǎng)皿中)，標(biāo)記日期、所用培養(yǎng)基名稱和細(xì)胞名稱。

4)用廢液泵(吸力不要太大)取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取1mL新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后(充分混勻)，將CAL27細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻細(xì)胞(一般培養(yǎng)皿在臺子上畫30個8字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細(xì)胞。

5)確定CAL-27細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入CO2培養(yǎng)箱過夜。(盡量平直放入不要晃動)，第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

CAL-27人舌鱗癌細(xì)胞傳代操作

從培養(yǎng)箱拿出CAL-27細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)CAL-27細(xì)胞狀態(tài)良好，且密度達(dá)到85%左右的時候即可進(jìn)行傳代;

打開廢液泵，用廢液泵吸頭(吸力不要太大)取一個藍(lán)色槍頭吸走上清廢液，用巴士管取4ml不含鈣、鎂離子的1xPBS(6cm皿)到細(xì)胞培養(yǎng)皿中(若是10cm皿則取8ml1xPBS)，輕輕晃動以清洗細(xì)胞表面1-2次;

用廢液泵吸走PBS廢液，加1mL消化液(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)于培養(yǎng)瓶中，拿起培養(yǎng)皿輕輕轉(zhuǎn)動以便胰酶浸泡到每個細(xì)胞，消化1-3min(根據(jù)細(xì)胞貼壁情況判斷，貼壁較牢的消化時間長一點或者放入CO2培養(yǎng)箱中消化幾分鐘)后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓變亮，一旦發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大，即將脫離培養(yǎng)皿底，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

用1ml移液槍輕柔吹打，保證培養(yǎng)皿底的每個角落都吹打到，邊緣處也不能忽略(吹打時盡量避免產(chǎn)生氣泡，因其對細(xì)胞有傷害;需輕柔吹打，用力吹打?qū)?xì)胞也有傷害)，把培養(yǎng)瓶中所有細(xì)胞懸液用吸1ml移液槍移入無菌離心管中。

將裝有CAL-27細(xì)胞懸液的離心管放入離心機(jī)中(配平)，1000轉(zhuǎn)離心3-5min，用廢液泵取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取1-2mL新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后(充分混勻)，將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻細(xì)胞(一般培養(yǎng)皿在臺子上畫30個8字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細(xì)胞。

確定CAL-27細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(盡量平直放入不要晃動)。第二天再觀察細(xì)胞密度。

CAL-27人舌鱗癌細(xì)胞凍存準(zhǔn)備

從培養(yǎng)箱拿出CAL-27細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞生長狀態(tài)良好且存活率高的狀態(tài)下，細(xì)胞密度達(dá)80–90%時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存操作，以T25瓶為例

CAL-27細(xì)胞凍存方法

a.收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶內(nèi)所有培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌離心管，裝入無菌離心管中，1000rpm條件下離心4min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

b.根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，在CAL-27細(xì)胞凍存管上貼上細(xì)胞標(biāo)簽(細(xì)胞標(biāo)簽上包含：細(xì)胞名稱、凍存日期、培養(yǎng)用的培養(yǎng)基)。

c.將凍存管入庫到-80度凍存盒里，放置24小時后，即可移入液氮中保存，標(biāo)記好入庫位置和凍存日期。

CAL-27人舌鱗癌細(xì)胞應(yīng)用

探討YAP對口腔鱗癌細(xì)胞CAL27的增殖和凋亡的影響,并研究其在體內(nèi)體外促腫瘤的作用和機(jī)制,為YAP基因作為口腔鱗癌治療新的靶點提供理論依據(jù)。

實驗方法

1.用免疫組化法檢測不同分化程度的口腔鱗癌和正?？谇簧掀そM織中YAP蛋白的表達(dá)情況。

2. 檢測YAP在4株口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平,并選擇CAL27作為進(jìn)一步的實驗材料。利用慢病毒載體轉(zhuǎn)染CAL27細(xì)胞,分別構(gòu)建敲除和過表達(dá)YAP基因及對照組的口腔鱗癌細(xì)胞系。通過QRT-PCR及Western blot檢測敲除和過表達(dá)效率。

3. 利用CCK-8細(xì)胞活力實驗,EdU染色法,克隆形成實驗來檢測敲除和過表達(dá)YAP對CAL27細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測YAP對細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。通過QRT-PCR及Western blot技術(shù)檢測C-MYC、BCL-2等周期和凋亡相關(guān)因子隨YAP表達(dá)改變時的情況。

4. 以不同濃度的Hippo-YAP信號通路抑制劑維替泊芬處理CAL27細(xì)胞,利用CCK-8細(xì)胞活力實驗、流式細(xì)胞術(shù)來檢測細(xì)胞增殖、凋亡和周期的改變;利用QRT-PCR及Western blot技術(shù)檢測C-MYC和BCL-2等因子隨抑制劑濃度改變情況。

5. 利用裸鼠成瘤實驗,將敲除組、過表達(dá)組及相應(yīng)對照組CAL27細(xì)胞注入到裸鼠皮下,觀察腫瘤生長情況,分析YAP的不同表達(dá)水平對口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展的影響。

實驗結(jié)果

1.YAP蛋白在正?？谇簧掀そM織中基本不表達(dá),或表達(dá)較弱;口腔鱗狀細(xì)胞癌中,YAP蛋白的表達(dá)水平較高,與腫瘤分化程度有關(guān)。

2. 在CAL27細(xì)胞中,YAP基因和蛋白表達(dá)水平適中。在敲除YAP基因后,YAP及其下游靶基因CTGF、ANKRD、CYR61表達(dá)水平明顯降低,同時細(xì)胞中總YAP和細(xì)胞核中YAP表達(dá)水平均降低。過表達(dá)YAP基因后,YAP及其下游靶基因CTGF、ANKRD、CYR61表達(dá)水平明顯升高,而細(xì)胞中總YAP和胞核中YAP表達(dá)水平均升高。

3.與對照組相比,敲除YAP基因后,CAL27細(xì)胞增殖較慢,細(xì)胞周期阻滯,同時早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞比例均升高;C-MYC和BCL-2mRNA及蛋白表達(dá)水平均降低;周期相關(guān)蛋白CyclinD1表達(dá)水平下降,促凋亡蛋白BAX、Caspase7表達(dá)水平升高。過表達(dá)YAP基因后,CAL27細(xì)胞增殖加快,細(xì)胞周期進(jìn)展加速,早、晚期凋亡細(xì)胞比例均降低;C-MYC和BCL-2表達(dá)水平升高;CyclinD1蛋白表達(dá)水平升高,BAX、Caspase7蛋白表達(dá)水平下降。

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