TU212人喉癌細(xì)胞簡(jiǎn)介

TU212人喉癌細(xì)胞源自喉上皮癌，近幾年的國(guó)際報(bào)道顯示，這株細(xì)胞與T404、T406、Tu 138、Tu 158LN、Tu 159、Tu 182等細(xì)胞，為同一種細(xì)胞。TU212細(xì)胞常用于藥物治療喉癌的機(jī)制研究。

TU212細(xì)胞形態(tài)特征

TU212來(lái)源于頭頸鱗癌，呈上皮細(xì)胞樣，鋪路石狀，貼壁生長(zhǎng)。常用于腫瘤增殖、侵襲、遷徙和凋亡實(shí)驗(yàn)，也適合轉(zhuǎn)染RNA，研究喉癌的發(fā)展機(jī)制。

TU212人喉癌細(xì)胞產(chǎn)品信息

細(xì)胞名稱：TU212人喉癌細(xì)胞

細(xì)胞別稱：Tu-212; Tu212; TU212; 人喉癌細(xì)胞

種屬來(lái)源：人

組織來(lái)源：頭頸鱗癌

生長(zhǎng)特性：貼壁生長(zhǎng)

細(xì)胞形態(tài)：上皮細(xì)胞樣

STR位點(diǎn)信息：Amelogenin：X;CSF1PO：12,13;D5S818：12;D7S820：10;D13S317：12;D16S539：8,9;TH01：8;TPOX：10,11;vWA：15,16

培養(yǎng)基：90%IMDM+10%FBS+PS

培養(yǎng)條件：氣相：95%空氣+5%二氧化碳;溫度：37℃

凍存條件：無(wú)血清凍存液，液氮儲(chǔ)存

TU212人喉癌細(xì)胞培養(yǎng)操作方法

細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件

實(shí)驗(yàn)室條件

1.無(wú)菌環(huán)境：無(wú)菌室包括更衣室，緩沖間，風(fēng)淋間，操作間

2.儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)-操作平臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱-細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境、倒置顯微鏡-觀察細(xì)胞、離心機(jī)-離心收集細(xì)胞、冰箱-放置培養(yǎng)基等試劑、水浴鍋-復(fù)蘇細(xì)胞、真空泵-收集廢液、滅菌鍋-滅菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-凍存細(xì)胞、純水儀-制備一級(jí)水

3.器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭(白色0-10ul;黃色20-200ul;藍(lán)色100-1000ul)、濾器，吸管，多孔培養(yǎng)皿、6cm皿、10cm皿，培養(yǎng)瓶等。

4.試劑：IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、FBS胎牛血清、雙抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)、pbs

操作者工作范疇

1.無(wú)菌操作：洗手，戴手套，穿實(shí)驗(yàn)服，常噴75%酒精

TU212人喉癌細(xì)胞復(fù)蘇步驟

1)準(zhǔn)備：紫外線照臺(tái)30min，提前打開水浴鍋設(shè)置37℃，培養(yǎng)基臨用前放水浴箱里溫育20分鐘(或者放在超凈工作臺(tái)常溫放30min)。在操作臺(tái)上擺放好物品，左邊放完全培養(yǎng)液，1mL槍頭(已滅菌)，培養(yǎng)皿，右上角放廢液缸，1mL移液槍，3mL巴氏管。檢查離心機(jī)，廢液泵。

2)待水浴鍋溫度達(dá)到37℃時(shí)，戴上手套和護(hù)目鏡，從-196℃液氮罐中取出凍存管，將含有1mLTU212細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，同時(shí)不斷輕輕搖動(dòng)凍存管，盡量保證凍存管內(nèi)細(xì)胞1min內(nèi)融化，加4mL培養(yǎng)基混合均勻，移入離心機(jī)中100rpm離心3min，以75%酒精噴凍存管外部，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。

3)用3mL巴氏管取5mL新鮮培養(yǎng)基到一個(gè)新的6cm培養(yǎng)皿中，(若離心后細(xì)胞量較多，可取12mL新鮮培養(yǎng)基到一個(gè)新的10cm培養(yǎng)皿中)，標(biāo)記日期、所用培養(yǎng)基名稱和細(xì)胞名稱。

4)用廢液泵(吸力不要太大)取一個(gè)黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取1mL新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后(充分混勻)，將TU212細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺(tái)上以畫“8”字法鋪勻細(xì)胞(一般培養(yǎng)皿在臺(tái)子上畫30個(gè)8字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測(cè)是否鋪勻細(xì)胞。

5)確定TU212細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入CO2培養(yǎng)箱過夜。(盡量平直放入不要晃動(dòng))，第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

TU212人喉癌細(xì)胞傳代操作

從培養(yǎng)箱拿出TU212細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)TU212細(xì)胞狀態(tài)良好，且密度達(dá)到85%左右的時(shí)候即可進(jìn)行傳代;

打開廢液泵，用廢液泵吸頭(吸力不要太大)取一個(gè)藍(lán)色槍頭吸走上清廢液，用巴士管取4ml不含鈣、鎂離子的1xPBS(6cm皿)到細(xì)胞培養(yǎng)皿中(若是10cm皿則取8ml1xPBS)，輕輕晃動(dòng)以清洗細(xì)胞表面1-2次;

用廢液泵吸走PBS廢液，加1mL消化液(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)于培養(yǎng)瓶中，拿起培養(yǎng)皿輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)以便胰酶浸泡到每個(gè)細(xì)胞，消化1-3min(根據(jù)細(xì)胞貼壁情況判斷，貼壁較牢的消化時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)或者放入CO2培養(yǎng)箱中消化幾分鐘)后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓變亮，一旦發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大，即將脫離培養(yǎng)皿底，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

用1ml移液槍輕柔吹打，保證培養(yǎng)皿底的每個(gè)角落都吹打到，邊緣處也不能忽略(吹打時(shí)盡量避免產(chǎn)生氣泡，因其對(duì)細(xì)胞有傷害;需輕柔吹打，用力吹打?qū)?xì)胞也有傷害)，把培養(yǎng)瓶中所有細(xì)胞懸液用吸1ml移液槍移入無(wú)菌離心管中。

將裝有TU212細(xì)胞懸液的離心管放入離心機(jī)中(配平)，1000轉(zhuǎn)離心3-5min，用廢液泵取一個(gè)黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取1-2mL新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后(充分混勻)，將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺(tái)上以畫“8”字法鋪勻細(xì)胞(一般培養(yǎng)皿在臺(tái)子上畫30個(gè)8字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測(cè)是否鋪勻細(xì)胞。

確定TU212細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(盡量平直放入不要晃動(dòng))。第二天再觀察細(xì)胞密度。

TU212人喉癌細(xì)胞凍存準(zhǔn)備

從培養(yǎng)箱拿出TU212細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好且存活率高的狀態(tài)下，細(xì)胞密度達(dá)80–90%時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存操作，以T25瓶為例

TU212人喉癌細(xì)胞凍存方法

a.收集細(xì)胞及TU212細(xì)胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)所有培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管，裝入無(wú)菌離心管中，1000rpm條件下離心4min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b.根據(jù)TU212細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，在TU212細(xì)胞凍存管上貼上細(xì)胞標(biāo)簽(細(xì)胞標(biāo)簽上包含：細(xì)胞名稱、凍存日期、培養(yǎng)用的培養(yǎng)基)。

c.將凍存管入庫(kù)到-80度凍存盒里，放置24小時(shí)后，即可移入液氮中保存，標(biāo)記好入庫(kù)位置和凍存日期。

TU212人喉癌細(xì)胞應(yīng)用

人喉表皮樣癌細(xì)胞可以用于miR-362-3p在喉癌中表達(dá)和影響喉癌細(xì)胞遷移作用機(jī)制的初步研究。

運(yùn)用相關(guān)分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)miR-362-3p在喉癌中表達(dá)水平、臨床意義及其對(duì)喉癌細(xì)胞遷移侵襲能力的影響,預(yù)測(cè)miR-362-3p的潛在靶基因ALDOA,研究其是否通過ALDOA參與喉癌細(xì)胞的遷移侵襲,為尋找喉癌早期診斷和預(yù)后判斷生物標(biāo)志物提供線索。

實(shí)驗(yàn)材料

1、細(xì)胞系:人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞系、人胚腎HEK293細(xì)胞、人咽鱗癌細(xì)胞系FADU、人喉癌細(xì)胞TU212。

2、組織標(biāo)本:收集2015年1月至2017年11月新鮮喉癌及相應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本50例,術(shù)后立即將組織置-80℃冰箱保存。所有組織標(biāo)本均經(jīng)病理醫(yī)生證實(shí),并獲得患者相關(guān)臨床資料信息。經(jīng)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并獲得患者知情同意。

實(shí)驗(yàn)方法

1、細(xì)胞培養(yǎng)；

2、基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)；

3、qRT-PCR檢測(cè)；

4、Western blot檢測(cè)；

5、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)；

6、Transwell小室檢測(cè)法；

7、臨床資料分析；

8、統(tǒng)計(jì)分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、qRT-PCR結(jié)果顯示,miR-362-3p在喉癌組織中的表達(dá)水平較癌旁組織顯著升高(P<0.05);同時(shí),miR-362-3p在喉癌Hep2細(xì)胞中的表達(dá)水平較HEK293細(xì)胞顯著升高(P<0.05)。提示miR-362-3p在喉癌中可能發(fā)揮癌基因作用。

2、單因素方差分析結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,miR-362-3p在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和較高級(jí)別臨床分期的喉癌患者癌組織中表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05),而在不同年齡、性別、分化程度和浸潤(rùn)深度癌組織中表達(dá)水平無(wú)顯著差異(P>0.05),提示miR-362-3p與喉癌的惡性程度有關(guān)。

3、qRT-PCR結(jié)果顯示,miR-362-3p在轉(zhuǎn)染miR-362-3p mimic或miR-362-3p inhibitor的Hep2細(xì)胞中表達(dá)水平較對(duì)照組(nc)分別顯著升高或降低(P<0.05),證明轉(zhuǎn)染成功。Transwell小室檢測(cè)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,miR-362-3p mimic轉(zhuǎn)染組中Hep2細(xì)胞遷移數(shù)量和遷移距離較對(duì)照組(nc)顯著增加(P<0.05),miR-362-3p inhibitor轉(zhuǎn)染組中Hep2細(xì)胞遷移數(shù)量和遷移距離較對(duì)照組(nc)顯著減少(P<0.05),提示miR-362-3p促進(jìn)Hep2細(xì)胞遷移。

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