OCM-1A人眼脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞背景簡介

OCM-1A細胞系，人脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞具有高度增殖能力和侵襲性，能夠迅速擴散到周圍組織和遠處器官。因此，它被廣泛用于評估抗腫瘤藥物的療效和毒性，以及開發(fā)新型的抗腫瘤治療方法。此外，OCM-1A細胞系也被用于研究腫瘤發(fā)生和發(fā)展的機制，以及探索新的靶點和治療方法。

OCM-1A人眼脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞產(chǎn)品信息

細胞名稱：OCM-1A人眼脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞

細胞別稱：OCM1A; OCM1a; 人低侵襲性脈絡(luò)膜黑色素瘤

種屬來源：人

組織來源：皮膚

形態(tài)特性：貼壁生長，上皮細胞樣

STR位點信息：Amelogenin：X;CSF1PO：11;D2S1338：19;D3S1358：14,16;D5S818：11,12;D7S820：8,10;D8S1179：13;D13S317：12;D16S539：9;D18S51：13,18;D19S433：14,15;D21S11：30;FGA：21;TH01：6,7;TPOX：8,11;vWA：18

保藏機構(gòu)：cancercelllines; CVCL_6935

培養(yǎng)基：DMEM+10%FBS+PS

培養(yǎng)條件：氣相：95%空氣+5%二氧化碳;溫度：37℃

凍存條件：無血清凍存液，液氮儲存

OCM-1A人眼脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞培養(yǎng)操作方法

細胞培養(yǎng)的基本條件

實驗室條件

1.無菌環(huán)境：無菌室包括更衣室，緩沖間，風(fēng)淋間，操作間

2.儀器設(shè)備：超凈工作臺-操作平臺、CO2培養(yǎng)箱-細胞生長的環(huán)境、倒置顯微鏡-觀察細胞、離心機-離心收集細胞、冰箱-放置培養(yǎng)基等試劑、水浴鍋-復(fù)蘇細胞、真空泵-收集廢液、滅菌鍋-滅菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-凍存細胞、純水儀-制備一級水

3.器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭(白色0-10ul;黃色20-200ul;藍色100-1000ul)、濾器，吸管，多孔培養(yǎng)皿、6cm皿、10cm皿，培養(yǎng)瓶等。

4.試劑：DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、FBS胎牛血清、雙抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)、pbs

操作者工作范疇

1.無菌操作：洗手，戴手套，穿實驗服，常噴75%酒精

OCM-1A人眼脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞復(fù)蘇步驟

1)準(zhǔn)備：紫外線照臺30min，提前打開水浴鍋設(shè)置37℃，培養(yǎng)基臨用前放水浴箱里溫育20分鐘(或者放在超凈工作臺常溫放30min)。在操作臺上擺放好物品，左邊放完全培養(yǎng)液，1mL槍頭(已滅菌)，培養(yǎng)皿，右上角放廢液缸，1mL移液槍，3mL巴氏管。檢查離心機，廢液泵。

2)待水浴鍋溫度達到37℃時，戴上手套和護目鏡，從-196℃液氮罐中取出凍存管，將含有1mLOCM-1A細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，同時不斷輕輕搖動凍存管，盡量保證凍存管內(nèi)細胞1min內(nèi)融化，加4mL培養(yǎng)基混合均勻，移入離心機中100rpm離心3min，以75%酒精噴凍存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。

3)用3mL巴氏管取5mL新鮮培養(yǎng)基到一個新的6cm培養(yǎng)皿中，(若離心后細胞量較多，可取12mL新鮮培養(yǎng)基到一個新的10cm培養(yǎng)皿中)，標(biāo)記日期、所用培養(yǎng)基名稱和細胞名稱。

4)用廢液泵(吸力不要太大)取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取1mL新鮮培養(yǎng)基重懸細胞后(充分混勻)，將OCM-1A細胞懸液加入到培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻細胞(一般培養(yǎng)皿在臺子上畫30個8字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細胞。

5)確定OCM-1A細胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入CO2培養(yǎng)箱過夜。(盡量平直放入不要晃動)，第二天換液并檢查細胞密度。

OCM-1A人眼脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞傳代方法

從培養(yǎng)箱拿出OCM-1A細胞，在顯微鏡下觀察細胞密度和細胞狀態(tài)，當(dāng)OCM-1A細胞狀態(tài)良好，且密度達到85%左右的時候即可進行傳代;

打開廢液泵，用廢液泵吸頭(吸力不要太大)取一個藍色槍頭吸走上清廢液，用巴士管取4ml不含鈣、鎂離子的1xPBS(6cm皿)到細胞培養(yǎng)皿中(若是10cm皿則取8ml1xPBS)，輕輕晃動以清洗細胞表面1-2次;

用廢液泵吸走PBS廢液，加1mL消化液(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)于培養(yǎng)瓶中，拿起培養(yǎng)皿輕輕轉(zhuǎn)動以便胰酶浸泡到每個細胞，消化1-3min(根據(jù)細胞貼壁情況判斷，貼壁較牢的消化時間長一點或者放入CO2培養(yǎng)箱中消化幾分鐘)后，在顯微鏡下觀察細胞是否變圓變亮，一旦發(fā)現(xiàn)大量細胞胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大，即將脫離培養(yǎng)皿底，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

用1ml移液槍輕柔吹打，保證培養(yǎng)皿底的每個角落都吹打到，邊緣處也不能忽略(吹打時盡量避免產(chǎn)生氣泡，因其對細胞有傷害;需輕柔吹打，用力吹打?qū)毎灿袀?，把培養(yǎng)瓶中所有細胞懸液用吸1ml移液槍移入無菌離心管中。

將裝有OCM-1A細胞懸液的離心管放入離心機中(配平)，1000轉(zhuǎn)離心3-5min，用廢液泵取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取1-2mL新鮮培養(yǎng)基重懸細胞后(充分混勻)，將細胞懸液按1:2比例分到新的含8mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻細胞(一般培養(yǎng)皿在臺子上畫30個8字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細胞。

確定OCM-1A細胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(盡量平直放入不要晃動)。第二天再觀察細胞密度。

OCM-1A人眼脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞凍存準(zhǔn)備

從培養(yǎng)箱拿出OCM-1A細胞，在顯微鏡下觀察細胞密度和細胞狀態(tài)，待細胞生長狀態(tài)良好且存活率高的狀態(tài)下，細胞密度達80–90%時，可進行細胞凍存操作，以T25瓶為例

細胞凍存步驟

a.收集OCM-1A細胞及細胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶內(nèi)所有培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌離心管，裝入無菌離心管中，1000rpm條件下離心4min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。

b.根據(jù)OCM-1A細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，在OCM-1A細胞凍存管上貼上細胞標(biāo)簽(細胞標(biāo)簽上包含：細胞名稱、凍存日期、培養(yǎng)用的培養(yǎng)基)。

c.將凍存管入庫到-80度凍存盒里，放置24小時后，即可移入液氮中保存，標(biāo)記好入庫位置和凍存日期。

OCM-1A人眼脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞應(yīng)用

OCM-1A細胞系|人脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞可以用于miR-200c/Zeb1負反饋回路對眼內(nèi)腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及成瘤性的作用

研究microRNA-200c與Zeb1構(gòu)成的雙向負反饋調(diào)節(jié)通道對眼內(nèi)惡性腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、成瘤能力及遷徙轉(zhuǎn)移能力的調(diào)控作用。

方法

①miR-200c對眼內(nèi)腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及遷徙能力的調(diào)控。①建立miR-200c過表達及表達抑制的細胞模型。應(yīng)用miR-200c的模擬物和抑制劑對人眼脈絡(luò)膜黑色素瘤細胞株OCM-1、人視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞株WERI-RB1和Y79進行瞬時轉(zhuǎn)染,在三個細胞株中建立miR-200c過表達及表達抑制的細胞模型。通過對miR-2O0c載體所攜帶的FAM熒光對轉(zhuǎn)染后的細胞內(nèi)的熒光表達情況進行熒光顯微鏡下的肉眼觀察,初步評估轉(zhuǎn)染效率。應(yīng)用實時定量PCR對轉(zhuǎn)染前后各株細胞中miR-200c的表達水平進行檢測進一步評估轉(zhuǎn)染效率。

②miR-200c對其靶基因——上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的重要轉(zhuǎn)錄因子Zeb1的調(diào)節(jié)作用。使用實時定量PCR、免疫印跡法及免疫熒光等分子生物學(xué)檢測方法對OCM-1、WERI-RB1和Y79細胞miR-200c轉(zhuǎn)染前后細胞內(nèi)的Zeb1因子在mRNA和蛋白水平的表達進行檢測,以驗證miR-200c在眼內(nèi)腫瘤對Zebl的調(diào)控作用。

③miR-200c對眼內(nèi)腫瘤細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控。使用實時定量PCR、免疫印跡法及免疫熒光等分子生物學(xué)檢測方法,對三個細胞株miR-200c轉(zhuǎn)染前后細胞內(nèi)上皮標(biāo)記因子E-cadherin、間質(zhì)標(biāo)記因子Vimentin和N-cadherin分別進行不同表達水平的定性、定量和定位,以檢驗miR-200c對上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化因子的調(diào)控作用。

④miR-200c對眼內(nèi)腫瘤細胞體外遷徙能力的調(diào)控。利用Transwell小室對OCM-1和Y79細胞各組(未轉(zhuǎn)染組、空白對照轉(zhuǎn)染組、模擬物WERI-RB1轉(zhuǎn)染組、抑制劑轉(zhuǎn)染組)進行體外透膜遷徙能力檢測,以評估的表達干擾對眼內(nèi)腫瘤細胞運動能力的作用。

參考文獻

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