原代人口腔黏膜上皮細(xì)胞背景簡介

人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞分離自皮膚組織;表皮位于動(dòng)物皮膚的外層，由胚胎時(shí)期外胚層形成，具有抗摩擦和抗損傷的作用。表皮是皮膚的淺層結(jié)構(gòu)，由復(fù)層扁平上皮構(gòu)成。從基底層到表面可分為五層，即基底層、棘層、顆粒層、透明層和角質(zhì)層。表皮角質(zhì)形成細(xì)胞是一種能合成角質(zhì)蛋白的上皮細(xì)胞，此類細(xì)胞為表皮的主體，由表皮深層始逐漸增殖、分化，并在成為角化的角質(zhì)細(xì)胞中，細(xì)胞核與細(xì)胞器完全消失，細(xì)胞亦失去生理功能而脫落。未脫落部分對(duì)機(jī)體尚有保護(hù)作用，故不必在洗擦身體時(shí)用力搓擦，使其過早脫失。表皮角質(zhì)形成細(xì)胞主要分布于表皮基底層，在上皮程序性死亡后，細(xì)胞產(chǎn)生角化并移向表皮。體外培養(yǎng)的表皮角化細(xì)胞容易導(dǎo)致終末分化，不能充分增殖。角質(zhì)形成細(xì)胞最終產(chǎn)生角質(zhì)蛋白，在其向角質(zhì)細(xì)胞演變過程中，一般可以分為四層，即基底層、棘層、顆粒層以及角質(zhì)層。有人把前三層或前二層稱為生發(fā)層或馬爾匹基層。此外，在某些部位，特別在掌跖部位，角質(zhì)層下方還可見到透明層。

皮膚不但是人體的生理屏障，而且在機(jī)體免疫和內(nèi)分泌等方面起著極其重要的作用。 角質(zhì)形成細(xì)胞是表皮細(xì)胞的主要組成部分，角質(zhì)形成細(xì)胞的體外培養(yǎng)可為皮膚毒理學(xué)、燒傷治療學(xué)、美容學(xué)和皮膚病發(fā)病機(jī)制的研究提供新的途徑。 但是，皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞分離培養(yǎng)中存在細(xì)胞易分化、易受成纖維細(xì)胞污染、不易貼壁等問題，因此，建立一種操作簡便、細(xì)胞活性優(yōu)良的人角質(zhì)形成細(xì)胞分離培養(yǎng)方法具有重要的意義。

人口腔黏膜上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)方法

人口腔黏膜上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)主要試劑與儀器

角質(zhì)細(xì)胞專用培養(yǎng)基，角質(zhì)細(xì)胞組織消化液I，角質(zhì)細(xì)胞組織消化液II，胎牛血清，DMSO，雙抗，慶大霉素，T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，細(xì)胞培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)，低速離心機(jī)，手術(shù)刀片，尖頭鑷等

人口腔黏膜上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)操作過程

1. 獲取要求組織寬度大于3mm。在手術(shù)室中將組織置于預(yù)冷至4℃、含0.5%雙抗的無菌PBS緩沖液中，保證組織完全浸沒

2. 用含0.5%雙抗的PBS緩沖液反復(fù)沖洗組織塊10~15遍直至組織塊表面無肉眼可見的污物。用眼科剪仔細(xì)剪凈組織塊的黏膜下組織，只留黏膜層，要求盡量平整，不剪碎、剪破組織塊

3. 再次用含0.5%雙抗的PBS緩沖液沖洗處理后的組織塊，并用眼科剪剪成約5mm×5mm的小塊，完全浸入角質(zhì)細(xì)胞組織消化液I的中，將1.5ml離心管用錫紙包裹緊密以避光，置于4℃冰箱中消化18~20h。

酶消化法

1. 次日，采用酶消化法處理組織塊。將1.5ml EP管取出，于超凈臺(tái)中打開，用含0.5%雙抗的PBS緩沖液反復(fù)沖洗?？捎^察到皮膚上皮層呈現(xiàn)淡黃色，用眼科鑷輕輕撕下上皮層，反復(fù)沖洗至清亮透明

2. 置于加入了角質(zhì)細(xì)胞組織消化液II的培養(yǎng)皿中，用眼科剪輕柔地將上皮盡量剪碎，防止破壞培養(yǎng)皿底部導(dǎo)致污染。完全剪碎后，將培養(yǎng)皿蓋好并用封口膜封住，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化15min，每隔5min取出至超凈臺(tái)中反復(fù)吹打混勻。

3. 15min后，加入1ml胎牛血清終止消化，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000r/min離心5min

4. 吸出上清液并將細(xì)胞沉淀輕輕重懸于1 ml角質(zhì)細(xì)胞專用培養(yǎng)基中，計(jì)數(shù)

5. 以 5 x 104 /cm2的密度接種預(yù)先包被明膠的培養(yǎng)皿中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)

6. 初始接種后24小時(shí)更換培養(yǎng)基以去除未附著的細(xì)胞，并每天更換培養(yǎng)基，直到細(xì)胞達(dá)到所需的匯合度。

人口腔黏膜上皮細(xì)胞鑒定

1.形態(tài)學(xué)鑒定

角質(zhì)形成細(xì)胞剛接種時(shí)呈球形，折光性強(qiáng)，輪廓清晰，24h可見部分細(xì)胞貼壁并形成集落，貼壁細(xì)胞呈多角形，胞漿透亮，胞核較大，內(nèi)含1-2個(gè)核仁。5d后集落周圍出現(xiàn)淡色衛(wèi)星樣細(xì)胞增殖，胞漿豐富，均勻透亮;細(xì)胞長滿單層后，呈現(xiàn)典型的鋪路石狀，細(xì)胞呈多角形，細(xì)胞之間出現(xiàn)“拉網(wǎng)”現(xiàn)象。10d后細(xì)胞大部融合成片。

2.標(biāo)志物檢測

Cytokeratin-18(CK18)是基底層角質(zhì)形成細(xì)胞的陽性標(biāo)記物。鏡下可見培養(yǎng)細(xì)胞cK18免疫熒光染色顯示為陽性，證實(shí)培養(yǎng)細(xì)胞為基底層角質(zhì)形成細(xì)胞。