人外周血CD8+T細胞背景介紹

CD8+T-αβ細胞發(fā)育始于胸腺的淋巴祖細胞，在胸腺細胞變成單陽性(SP)CD8+或CD4+胸腺細胞(圖2)[2]之前，淋巴祖細胞先后經(jīng)歷雙陰性(DN)(CD8– CD4–)階段和雙陽性(DP)階段(CD8+ CD4+)。關(guān)于CD8+T細胞如何形成特異性，DP細胞通過與肽：MHC I類復(fù)合物的相互作用在胸腺皮質(zhì)中進行陽性選擇，生成CD8+SP細胞。隨后這些SP細胞從皮質(zhì)遷移到髓質(zhì)，然后將在髓質(zhì)中進行陰性克隆選擇，以去除與自身抗原高親和力結(jié)合的T細胞。最后，成熟單陽性CD8+T-αβ細胞被釋放到循環(huán)中。

人外周血CD8+T細胞分離,培養(yǎng)步驟

人外周血CD8+T細胞分離培養(yǎng)主要試劑

人外周血淋巴細胞分離液，人外周血淋巴細胞清洗液，rhIL-2，IFN-γ，581培養(yǎng)基，CD8+T分選磁珠，MS分選柱，Multi Stand磁力架

人外周血CD8+T細胞分離,培養(yǎng)操作過程

1.細胞分離

(1) 抽取健康供者外周血10 mL，將血標本緩慢加入兩個盛有5 mL外周血淋巴細胞分離液的15 mL無菌離心管中，保持界面清晰。

(2) 400g，30-40 min。

(3) 離心后，此時離心管中由上至下分為四層。第一層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴 細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。

(4) 取白環(huán)層，加入 3 倍體積的清洗液混勻，60-100 g，離心 10 min，

(5) 棄上清。加 6-8 mL 清洗液混勻，60-100 g，離心10 min，棄去上清后以0.2 mL培養(yǎng)基重懸細胞后移入0.5 mL EP管。

(6) 取20 μL CD8+T細胞分選磁珠，加入細胞懸液，混勻。4℃孵育20 min，每5 min輕輕彈一次。

(7) 過MS分選柱: 將MS柱放入Vario MACS分選系統(tǒng)的磁場;加500 μL buffer沖洗MS柱;待buffer完全過柱后，加入細胞懸液，收集流出液——未標記細胞;待細胞完全過柱后，加buffer洗MS柱(3×1 mL)，最后用配套的活塞推出CD8+T細胞于0.5 mL EP管中。

人外周血CD8+T細胞擴增培養(yǎng)步驟

加入CD8+T細胞完全培養(yǎng)基，CD3/CD28磁珠，將CD8+T細胞移入T25培養(yǎng)瓶，密度為5x105/mL。當(dāng)細胞密度超過1x106后進行等量補液。培養(yǎng)體積擴大后依次轉(zhuǎn)入T75和T175進行擴增。