產(chǎn)品介紹

由IMMOCELL研發(fā)團(tuán)隊(duì)精心研制的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化試劑盒，包含適合間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基、優(yōu)級(jí)胎牛血清及誘導(dǎo)細(xì)胞分化所需的添加物。 本產(chǎn)品適用于間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)分化。大量細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)據(jù)驗(yàn)證，本產(chǎn)品可穩(wěn)定、高效誘導(dǎo)上述細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞。  

注意：本產(chǎn)品僅提供給進(jìn)一步科研使用，不可用于臨床治療等其他用途。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化試劑套裝說明書下載

成骨分化套裝

實(shí)驗(yàn)原理

間質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化是理解骨形成機(jī)制的有力工具，它也被用于鑒別骨質(zhì)疏松癥、骨修復(fù)和成骨不全等遺傳紊亂疾病。

成骨過程是一個(gè)完整的骨代謝調(diào)控負(fù)反饋環(huán)路。不同階段的細(xì)胞群之間無明顯的界限，它們是一個(gè)連續(xù)發(fā)生發(fā)展的過程。具體過程如下：

1)多種刺激因子和激素的刺激及其他特定的理化因素作用下，間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為骨原細(xì)胞;

2)其后，骨原細(xì)胞進(jìn)一步分化為成骨細(xì)胞前體細(xì)胞，進(jìn)入快速增殖期;

3)細(xì)胞增殖能力逐漸下降，細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix，ECM)成熟相關(guān)基因(堿性磷酸酶、I型膠原、基質(zhì)鈣蛋白)被進(jìn)一步激活，成骨細(xì)胞在此階段合成和分泌有機(jī)基質(zhì)，形成類骨質(zhì)，主要由I型膠原形成，特征物是堿性磷酸酶，是成骨細(xì)胞分化成熟的早期標(biāo)志;

4)成熟的成骨細(xì)胞表達(dá)ECM鈣化相關(guān)蛋白，主要是骨鈣蛋白和骨橋蛋白，成骨細(xì)胞礦化活力顯著升高。

質(zhì)量控制

通過細(xì)菌、真菌、支原體、內(nèi)毒素檢測(cè)。

通過滲透壓、pH檢測(cè)。

通過產(chǎn)品性能檢測(cè)

處理原則

1.嚴(yán)格的無菌環(huán)境。務(wù)必保證實(shí)驗(yàn)室整體和操作區(qū)域的清潔。

2.規(guī)范的操作方式。請(qǐng)按照產(chǎn)品說明書描述的方式操作，嚴(yán)格控制變量，做好對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

3.各成分需按照保存條件妥善存放，并盡快使用。

4.若短期內(nèi)無法用完整套培養(yǎng)基，應(yīng)按套裝內(nèi)各成分體積比例分批配制并分裝保存。

產(chǎn)品穩(wěn)定性及保存條件

1.套裝內(nèi)所有成分均需避光保存。

2.套裝內(nèi)基礎(chǔ)培養(yǎng)基需置于4℃冰箱保存，保質(zhì)期為1年；其他成分需置于-20℃保存，保質(zhì)期為2年。

3.配制后的完全培養(yǎng)基，需放置4℃保存，保質(zhì)期為1個(gè)月；若能保證培養(yǎng)條件穩(wěn)定，容器密封性能良好，避免冷熱交替，則保質(zhì)期可適當(dāng)延長(zhǎng)，但不得超過45天。

4.所有產(chǎn)品請(qǐng)于保質(zhì)期內(nèi)使用；過期的成分可能嚴(yán)重影響培養(yǎng)效果

完全培養(yǎng)基的配制

所需材料

1.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化試劑盒

2.清潔、無菌、質(zhì)量穩(wěn)定的一次性耗材（移液管、移液器吸頭、離心管等）

3.潔凈的封口膜

4.鋁箔紙等避光材料

操作步驟

1.配制前至少6h，將套裝中的優(yōu)級(jí)胎牛血清(以下簡(jiǎn)稱血清)放置于4℃冰箱內(nèi)完全融化。

注意：融化后的血清中可能出現(xiàn)絮狀物，其主要成分為析出的血纖蛋白，這不會(huì)影響產(chǎn)品使用效果。若不是對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)體系的純凈度要求極高，我們不建議過濾或離心去除絮狀物。

2.配制前至少30min，將套裝中人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化添加物（以下簡(jiǎn)稱添加物）放置于4℃冰箱內(nèi)，直至完全融化。

3.上下顛倒或輕彈試劑管以混勻試劑。

4.用75%醫(yī)用酒精仔細(xì)擦拭所有成分外包裝。在超凈臺(tái)內(nèi)打開包裝。

5.將血清、添加物全部加入細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基（以下簡(jiǎn)稱基礎(chǔ)培養(yǎng)基）中。

6.取少量基礎(chǔ)培養(yǎng)基，洗滌各瓶、管，盡可能將所有成分全部加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。

7.擰緊基礎(chǔ)培養(yǎng)基瓶蓋，輕柔并充分搖勻。

8.用封口膜密封瓶口，用鋁箔紙包裹瓶身，并標(biāo)注名稱、配制日期等信息。

特別提醒

1.若短期內(nèi)無法用完全部培養(yǎng)基，我們建議分批配制；請(qǐng)按照套裝內(nèi)各成分比例，配制所需量；但剩余的成分必須嚴(yán)格按照各自的保存條件妥善保存，并且不可多次凍融。

2.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化試劑盒內(nèi)的所有成分都嚴(yán)格控制無菌，一般情況下我們不建議再次除菌。若配制過程有污染風(fēng)險(xiǎn)，可將完全培養(yǎng)基過濾除菌。

3.配制完成的成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，請(qǐng)分裝為小份，避免整瓶培養(yǎng)基反復(fù)溫浴和冷藏交替

誘導(dǎo)分化操作流程

所需材料

1.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化試劑盒

2.0.1%明膠溶液

3.Phosphate-BufferedSaline（1×PBS）

操作步驟

注意

1)本操作規(guī)程以六孔板為例，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況選用合適的培養(yǎng)容器；

2)為減少誘導(dǎo)過程細(xì)胞漂起、不貼壁，建議使用明膠包被培養(yǎng)容器；

3)誘導(dǎo)培養(yǎng)基在使用前均需預(yù)熱至37℃。

1.加1mL0.1%明膠到六孔板中，搖勻，使其能均勻覆蓋各孔底面。

2.將鋪有0.1%明膠的六孔板放置在超凈臺(tái)或CO2培養(yǎng)箱至少30min。

3.30min后吸去明膠即可用于接種細(xì)胞，或等待六孔板晾干再接種。

4.將待誘導(dǎo)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞按照2×104cells/cm2的細(xì)胞密度接種于六孔板中，每孔加入2mL普通完全培養(yǎng)基。

5.細(xì)胞置于37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

6.當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%時(shí)，小心地將孔內(nèi)完全培養(yǎng)基吸走，向六孔板中加入2mL人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。

7.每隔3天換用新鮮的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。

8.誘導(dǎo)2~4周后，視細(xì)胞的形態(tài)變化及生長(zhǎng)情況，用茜素紅進(jìn)行染色。

注意：為防止成骨細(xì)胞脫落、鈣結(jié)節(jié)損失，建議成骨過程中出現(xiàn)明顯鈣結(jié)節(jié)之后，每三天半量換液一次

茜素紅染色分析

所需材料

1.Phosphate-BufferedSaline（1×PBS）

2.4%多聚甲醛溶液或10%福爾馬林溶液

3.茜素紅染色液

操作步驟

注意：

1)為防止鈣結(jié)節(jié)脫落，所有操作盡可能輕緩；

2)茜素紅使用前請(qǐng)恢復(fù)至室溫;如果染色效果較差，可適當(dāng)延長(zhǎng)染色時(shí)間；

3)請(qǐng)確認(rèn)出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)后再進(jìn)行染色。

1.成骨誘導(dǎo)分化結(jié)束后，吸去六孔板中的成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基，用1×PBS輕柔洗滌2~3次。

2.每孔加入2mL4%多聚甲醛溶液（或10%福爾馬林），室溫固定30min。

3.吸去固定液，用1×PBS輕柔洗滌2~3次，確保將固定液清洗徹底。

4.每孔加入2mL茜素紅工作液，室溫染色5~10min。

5.吸去茜素紅染色液，用1×PBS輕柔洗滌2~3次，充分洗去多余染色液。

6.每孔加入2mL1×PBS，將培養(yǎng)板置于顯微鏡下觀察成骨染色效果。

7.染色后的六孔板用封口膜封裝后，置于4℃可保存2周

染色效果圖