NK細(xì)胞介紹

NK細(xì)胞(natural killer cell, NK)通常被稱作自然殺傷細(xì)胞，無須抗原預(yù)先致敏即可直接殺傷某些靶細(xì)胞，包括腫瘤細(xì)胞、病毒或細(xì)菌感染的細(xì)胞。

NK細(xì)胞是機(jī)體重要的天然免疫細(xì)胞之一，主要存在于脾臟和外周血中。當(dāng)感染首次發(fā)生時(shí)，NK細(xì)胞能主動(dòng)出擊，殺死被感染的細(xì)胞，因此也被稱為“天然殺手”。

人外周血NK細(xì)胞分離培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)室采用獨(dú)有的細(xì)胞因子培養(yǎng)法，將外周血中的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，經(jīng)過14天的誘導(dǎo)培養(yǎng)，CD3-/CD56+NK細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量可擴(kuò)增達(dá)到1000倍，其純度可達(dá)80%以上。

優(yōu)勢(shì)

1.無需預(yù)包被，操作簡(jiǎn)單；

2.擴(kuò)增效率高；

3.目的細(xì)胞百分比高的特點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

(1)提前開啟紫外線照射超凈臺(tái)30min。

(2)紫外照射完畢后，75%酒精消毒超凈臺(tái)，超凈臺(tái)通風(fēng)10min以上。

(3)水浴鍋提前開啟，加熱至56攝氏度;

(4)KBM-581培養(yǎng)基、IL-2提前從冰箱取出，放至室溫。

試劑耗材

試劑：人PBMC細(xì)胞分離液、清洗液、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、581培養(yǎng)基(圖片)

耗材：10ml移液管，15ml離心管，采血管，T75培養(yǎng)瓶(圖片)

儀器;離心機(jī)、CO2培養(yǎng)箱、冰箱、顯微鏡(圖片)

人外周血NK細(xì)胞實(shí)驗(yàn)步驟

(一)單個(gè)核細(xì)胞分離

血液樣本量10mL 時(shí)， 實(shí)驗(yàn)方法如下：

第一步：鋪血

1. 取2支 15mL 離心管， 各加入 5mL 分離液(與血液體積相同)。

2. 用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上;

第二步：離心

3.500xg，離心 20min。(分離PBMC時(shí)離心轉(zhuǎn)速設(shè)置為慢升慢降，升為9，降調(diào)為0;)

4. 離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。第一層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。(分層圖片)

第三步：血漿滅活

5. 收集血漿到新的離心管中;血漿56攝氏度30min滅活，900xg離心10min，取上清，置于-20℃，15min，再次900xg離心10min，取上清，置于4℃保存。

第四步：分離單個(gè)核細(xì)胞

6. 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層到另一50mL離心管中，向所得離心管中加入10mL 清洗液，混勻細(xì)胞。

第五步：清洗

7 . 300xg，離心 10min。

8 . 棄上清。

9. 用吸管以 10mL 清洗液重懸所得細(xì)胞。

10. 300xg，離心 10min。

11. 重復(fù) 7、 8、 9，棄上清后以 0.5mL (根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要重懸體積不等)后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。

(二)NK細(xì)胞培養(yǎng)

1. D0 ：將制備好的單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)重懸，按細(xì)胞密度1.0-2.0M cells/mL鋪于T-25瓶中。約用10ml 581培養(yǎng)基，培養(yǎng)基加入因子IL-2 (1000 U/mL)、IL-12(20 ng/mL)、IL-15 (20 ng/mL)、IL-18(100ng/mL)和5%自體血漿。

2. D4 ：補(bǔ)加10ml培養(yǎng)基(含IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和5%自體血漿)，此時(shí)瓶子含20mL培養(yǎng)基。

3. D6： 補(bǔ)加20ml培養(yǎng)基(含IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和5%自體血漿)，此時(shí)瓶里含有40ml培養(yǎng)基。

4. D8 ：往培養(yǎng)瓶補(bǔ)加40ml培養(yǎng)基(含IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和5%自體血漿)，同時(shí)加入IL-21(50 ng/mL)，此時(shí)瓶子含80mL 培養(yǎng)液。

5. D10：往培養(yǎng)瓶補(bǔ)加80ml培養(yǎng)基(含因子IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和5%自體血漿)，此時(shí)瓶子含160mL 培養(yǎng)液。

6. D12：往培養(yǎng)瓶補(bǔ)加160ml培養(yǎng)基(含因子IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21和5%自體血漿)，此時(shí)瓶子含320mL 培養(yǎng)液。

7. D14-15 ：收獲目的細(xì)胞。

注意事項(xiàng)：請(qǐng)勿吹打細(xì)胞，細(xì)胞維持抱團(tuán)生長(zhǎng)，如果聚團(tuán)過大，可輕揉或者拍打培養(yǎng)袋。如果想得到更理想的擴(kuò)增效果，可使用CD56抗體預(yù)包被瓶子。

流式鑒定細(xì)胞純度達(dá)80%以上