huvec細胞血管形成實驗背景簡介

HUVEC 是從臍帶靜脈內(nèi)壁分離出來的原代細胞。內(nèi)皮細胞常用于研究低氧、炎癥、氧化應(yīng)激、感染反應(yīng)及正常和腫瘤相關(guān)血管生成等應(yīng)用。

血管生成(Angiogenesis)是從已有的毛細血管或毛細血管后靜脈發(fā)展而形成新的血管，其對于器官生長、胚胎發(fā)育和傷口愈合在內(nèi)的多種過程十分重要。多種類型的內(nèi)皮細胞均可用于本實驗，包括原代細胞和永生化細胞系。常用的有人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)，之所以不采用靜脈血管內(nèi)皮細胞與動脈血管內(nèi)皮細胞是因為HUVEC具有干細胞的潛能，理論上可以傳代50-60次。

HUVEC細胞形態(tài)

HUVEC細胞特點

① 來源方便

HUVEC來源于新生兒的臍帶組織，容易獲取，沒有倫理爭議，且便于提取足量細胞。從人臍靜脈細小的血管組織中分離出內(nèi)皮細胞，原代提取及培養(yǎng)工作量大。

② 具有細胞成管的能力

此為內(nèi)皮細胞最基本的特征。

③ 原代HUVEC最接近人自體內(nèi)皮細胞，體現(xiàn)新生血管內(nèi)皮的特點。

材料準備

ECM內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基，DMEM培養(yǎng)基，基質(zhì)膠，胰酶，PBS磷酸緩沖液

操作步驟

A.準備基質(zhì)膠

1. 實驗前一天將基質(zhì)膠置于冰盒中，放入 4℃冰箱，使膠能過夜緩慢融化。(注意：同樣要準備一些4℃預(yù)冷的槍頭用于吸取基質(zhì)膠)

2. 開始實驗前，將基質(zhì)膠始終保持放在冰盒中。

3. 冰上操作。基質(zhì)膠用預(yù)冷槍頭混勻。

B.鋪基質(zhì)膠

由于每一批基質(zhì)膠濃度會有差異，建議使用前做1:1及2:1的稀釋，操作如下：

提前將96孔板和槍頭預(yù)冷，準備兩個預(yù)冷1.5 mL離心管用于稀釋基質(zhì)膠。按照想要的比例，稀釋完基質(zhì)膠后，于每孔中加入50 μL 基質(zhì)膠，避免產(chǎn)生氣泡。在37℃培養(yǎng)箱中放置45 min-1 h。(注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入基質(zhì)膠，防止有基質(zhì)膠流經(jīng)孔壁而留下殘留膠。若是孔的底部沒有鋪滿膠，可以晃動一下96孔板，使底部鋪膠均勻)例如：鋪原膠、稀釋1倍、稀釋0.5倍時，用DMEM稀釋。

C.鋪細胞

1.當(dāng)HUVEC細胞長滿70~80%時，消化下來，并用含10%FBS的DMEM 重懸，計數(shù)，使每孔加入50μL重懸液，濃度為30000個細胞/孔，重復(fù)三孔。(注意保持槍頭垂直在孔的上方，不要接觸到下面的凝膠。)

2.37℃培養(yǎng)箱孵育，四小時后可見血管形成。

HUVEC細胞血管實驗常見問題

1.稀釋基質(zhì)膠用什么稀釋?

用不加雙抗、不加胎牛血清的高糖的DMEM培養(yǎng)基稀釋。

2.怎么樣鋪膠均勻?

槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入基質(zhì)膠，防止有基質(zhì)膠流經(jīng)孔壁而留下殘留膠。若是孔的底部沒有鋪滿膠，可以晃動一下96孔板，使底部鋪膠均勻，若還是沒有均勻，可用槍頭稍微攪動一下。

3.進行血管形成實驗，應(yīng)該選用多大濃度的基質(zhì)膠呢?

最低濃度應(yīng)不低于10mg/mL， 基質(zhì)膠的稀釋比例是6 mg/mL以上。成管效果最好的是6-8 mg/mL

HUVEC細胞標志物熒光鑒定

HUVEC細胞成管實驗