HUVEC人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞永生化細(xì)胞背景簡(jiǎn)介

1984年，HUVEC細(xì)胞株由Hiroyoshi Hoshi、Wallace L.Mckeehan從一段長(zhǎng)約10-20cm的人正常臍帶靜脈中獲取、建立。

SetsukoShioda等人研究發(fā)現(xiàn)，HUVEC細(xì)胞株18-30代的倍增時(shí)間為23.5個(gè)小時(shí)，24-27代的倍增時(shí)間為67個(gè)小時(shí)，27-30代的倍增時(shí)間為84個(gè)小時(shí)，32-34代的倍增時(shí)間為100個(gè)小時(shí)。培養(yǎng)至40代后，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)多樣化，有些細(xì)胞變大或變小，有些細(xì)胞出現(xiàn)多核;細(xì)胞密度下降、倍增時(shí)間延長(zhǎng)。最后細(xì)胞在第54代停止生長(zhǎng)，ATCC的預(yù)期壽命也顯示在50-60代。

2018年，Setsuko Shioda等人發(fā)現(xiàn)HUVEC細(xì)胞株(passage 31)在貼壁匯合時(shí)細(xì)胞與細(xì)胞之間存在間隙，這與典型的內(nèi)皮細(xì)胞特征有所不同。

HUVEC人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞永生化培養(yǎng)說(shuō)明書(shū)下載

HUVEC細(xì)胞形態(tài)圖

HUVECC ATCC細(xì)胞形態(tài)圖

huvecs細(xì)胞的培養(yǎng)方法

huvecs細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

提前開(kāi)啟紫外照射30min消毒滅菌，工作臺(tái)開(kāi)燈通風(fēng)10min，用75%酒精擦拭臺(tái)面。

器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭(白色0-10ul;黃色20-200ul;藍(lán)色100-1000ul)、濾器、吸管、多孔培養(yǎng)皿、6cm皿、10cm皿，培養(yǎng)瓶等。

試劑：ECM完全培養(yǎng)基、PBS、消化液、凍存液。

HUVEC細(xì)胞復(fù)蘇操作

1.將含有1 mL HUVEC細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。

2.在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。

3.將所有HUVEC人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(永生化)懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜(或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6 cm皿中，加入約4 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜)。

4.第二天換液并檢查HUVEC人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞密度。

HUVEC細(xì)胞傳代步驟

HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基：內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基+5% FBS+1%內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)添加劑+1% P/S

推薦傳代比例：1:2至1:3

推薦換液頻率：每2-3天換液一次

倍增時(shí)間：~23.5 hours

消化時(shí)間：常溫消化2-3分鐘

培養(yǎng)條件：氣相：95%空氣+5%CO?，溫度：37℃

HUVEC細(xì)胞傳代方法

如果HUVEC細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗HUVEC細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有HUVEC人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-3 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若HUVEC細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將HUVEC細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

備注：收到HUVEC細(xì)胞后第一次傳代建議1：2傳代

HUVEC細(xì)胞凍存步驟

凍存條件

凍存液：無(wú)血清凍存液，液氮儲(chǔ)存

(即用型、無(wú)血清、無(wú)需程序降溫)

細(xì)胞凍存密度：5×10^6~1×10^7/mL

HUVEC細(xì)胞凍存方法

待HUVEC細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面 T25 瓶為例

1.收集HUVEC人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，然后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2.根據(jù)細(xì)胞數(shù)量對(duì)應(yīng)加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×10^6~1×10^7/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

3.將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

注意: 細(xì)胞不可長(zhǎng)期保存在-80℃冰箱中。建議24 h后盡快轉(zhuǎn)移至液氮中。

HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)要點(diǎn)

1.HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)難度較高，建議使用內(nèi)皮細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)基。

2.建議細(xì)胞前三次傳代中凍存部分細(xì)胞，后續(xù)遇到問(wèn)題可重新復(fù)蘇。

3.部分細(xì)胞傳代后細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)黑色小點(diǎn)，細(xì)胞間隙內(nèi)出現(xiàn)少量顆粒物或者培養(yǎng)基中浮游著少量死細(xì)胞等均為正?，F(xiàn)象，對(duì)細(xì)胞的增殖及試驗(yàn)無(wú)影響。

4.細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片，可以吸去細(xì)胞懸液后用PBS進(jìn)行清洗;如若PBS清洗后未能清除的碎片，可以用胰酶消化細(xì)胞重新接種，如果碎片較多，建議用PBS多清洗幾遍。

5.細(xì)胞傳代處理后的第二天，在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，如死細(xì)胞較多且細(xì)胞密度較低，需要進(jìn)行換液操作，也可視情況穩(wěn)定。

6.注意此細(xì)胞為SV40病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建的永生化細(xì)胞，細(xì)胞需要使用ECM專(zhuān)用的培養(yǎng)基。

7.HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，需要每?jī)商鞐壍襞f的培養(yǎng)基清洗并更換新的培養(yǎng)基，換液頻率要維持較高水平，以保證細(xì)胞的正常擴(kuò)增。

HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)問(wèn)題

HUVEC細(xì)胞必須用專(zhuān)用培養(yǎng)基嗎？

HUVEC細(xì)胞用普通培養(yǎng)基的話，還要添加生長(zhǎng)因子，常見(jiàn)的有ECGF/ECGF，ECGF，但價(jià)格貴，不如專(zhuān)用培養(yǎng)基來(lái)的劃算，故推薦使用專(zhuān)用培養(yǎng)基。

HUVEC細(xì)胞系換液第二天出現(xiàn)空泡化？

可能原因

1. 是培養(yǎng)液的pH值與細(xì)胞正常所需pH值差別太大，導(dǎo)致細(xì)胞代謝異常，出現(xiàn)空泡化;

2. 是在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，由于血清濃度不夠、藥物作用、外界刺激等情況下導(dǎo)致細(xì)胞代謝出現(xiàn)問(wèn)題，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀況下會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞空泡化的情況。

解決細(xì)胞空泡化方法

1. 測(cè)定完培的pH，看其酸堿性是否適宜。多數(shù)細(xì)胞適宜的pH范圍為7.2-7.4。

2. 若培基或血清是開(kāi)封存放很久的，可換用新鮮的完全培養(yǎng)基給細(xì)胞換液；若都是新開(kāi)封的，可換用新批次的基培或血配制培養(yǎng)液，給細(xì)胞換液觀察。

HUVEC培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)聚團(tuán)如何處理？

原因分析

可能由于培養(yǎng)板親水性差或者血清中的促貼壁因子不足。

解決辦法

1.培養(yǎng)瓶使用前一天使用明膠包被。

包被方法：以T25瓶為例，取用5ml明膠放入T25瓶，放置37℃下30分鐘以上，后將多余明膠吸出。

2.提高培養(yǎng)液中基質(zhì)膠濃度。

3.培養(yǎng)基使用ECM內(nèi)皮專(zhuān)用培養(yǎng)基進(jìn)行配置。