BT-474人乳腺導管癌細胞簡介

BT-474細胞是由E·Lasfargues和W·G·Coutinho從一名60歲白人女性乳腺癌患者實心的乳腺浸潤性導管癌中分離到的細胞株。BT-474[BT474]細胞可以用于3D細胞培養(yǎng)和癌癥研究。

BT-474人乳腺導管癌細胞形態(tài)特征

BT-474細胞呈島狀/片狀生長：這是該細胞的特性，是正常現(xiàn)象，并不是細胞發(fā)生“聚團”，無需擔心。

BT-474人乳腺導管癌細胞產品信息

細胞名稱：BT-474，人乳腺導管癌細胞

細胞別稱：Bt-474; BT474;人乳腺導管癌細胞

種屬來源：人

年齡性別：女;60歲

組織來源：乳腺，乳房 ;乳腺導管癌

生長特性：貼壁生長

細胞形態(tài)：上皮細胞樣

STR位點信息：Amelogenin：X;CSF1PO：10，11;D13S317：11;D16S539：9，11;D18S51：13，18;D19S433：14，17;D21S11：28，32.2;D2S1338：19;D3S1358：17;D5S818：11，13;D7S820：9，12;D8S1179：10，12;FGA：22，25;TH01：7;TPOX：8;vWA：15，16;

保藏機構：ATCC; CRL-7913 ATCC; HTB-20 BCRC; 60359 BCRJ; 0353 DSMZ; ACC-64 ;中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心

培養(yǎng)基：RPMI-1640+10%FBS+1%PS+10ug/ml牛胰島素(或重組人胰島素)

培養(yǎng)條件：氣相：95%空氣+5%二氧化碳;溫度：37℃

凍存條件：無血清凍存液，液氮儲存

倍增時間：84-100 hours

致瘤性：Yes, in Amsterdam/IMR rats with regression in 10 days. Yes, in nude mice.

BT-474人乳腺導管癌細胞培養(yǎng)操作說明

細胞培養(yǎng)的基本條件

實驗室條件

1. 無菌環(huán)境：無菌室包括更衣室，緩沖間，風淋間，操作間

2. 儀器設備：超凈工作臺-操作平臺、CO2 培養(yǎng)箱-細胞生長的環(huán)境、倒置顯微鏡-觀察細胞、離心機-離心收集細胞、冰箱-放置培養(yǎng)基等試劑、水浴鍋-復蘇細胞、真空泵-收集廢液、滅菌鍋-滅菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-凍存細胞、純水儀-制備一級水

3. 器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭(白色 0-10ul;黃色 20-200ul;藍色 100-1000ul)、濾器，吸管，多孔培養(yǎng)皿、6cm 皿、10cm 皿，培養(yǎng)瓶等。

4. 試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基、FBS胎牛血清、雙抗、牛胰島素(或重組人胰島素)、胰酶(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)、pbs

操作者工作范疇

1. 無菌操作：洗手，戴手套，穿實驗服，常噴 75%酒精

BT-474人乳腺導管癌細胞復蘇步驟

1.準備：紫外線照臺 30min，提前打開水浴鍋設置 37℃，培養(yǎng)基臨用前放水浴箱里溫育20 分鐘(或者放在超凈工作臺常溫放 30min)。在操作臺上擺放好物品，左邊放完全培養(yǎng)液，1mL 槍頭(已滅菌)，培養(yǎng)皿，右上角放廢液缸，1mL 移液槍，3mL 巴氏管。檢查離心機，廢液泵。

2)待水浴鍋溫度達到 37℃時，戴上手套和護目鏡，從-196℃液氮罐中取出凍存管，將含有1 mL細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，同時不斷輕輕搖動凍存管，盡量保證凍存管內細胞 1min 內融化，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻， 移入離心機中 100rpm 離心 3min，以 75%酒精噴凍存管外部，移入無菌操作臺內。

3)用 3mL 巴氏管取 5mL 新鮮培養(yǎng)基到一個新的 6cm 培養(yǎng)皿中，(若離心后細胞量較多，可取 12mL 新鮮培養(yǎng)基到一個新的 10cm 培養(yǎng)皿中)，標記日期、所用培養(yǎng)基名稱和細胞名稱。

4)用廢液泵(吸力不要太大)取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細胞后(充分混勻)，將BT474細胞懸液加入到培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻細胞(一般培養(yǎng)皿在臺子上畫 30 個 8 字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細胞。

5)確定BT474細胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱過夜。(盡量平直放入不要晃動)，第二天換液并檢查細胞密度。

BT-474人乳腺導管癌細胞傳代操作

從培養(yǎng)箱拿出BT-474細胞，在顯微鏡下觀察細胞密度和細胞狀態(tài)，當細胞狀態(tài)良好，且密度達到 85%左右的時候即可進行傳代;

打開廢液泵，用廢液泵吸頭(吸力不要太大)取一個藍色槍頭吸走上清廢液，用巴士管取 4ml 不含鈣、鎂離子的1xPBS(6cm 皿)到細胞培養(yǎng)皿中(若是 10cm 皿則取 8ml 1xPBS)，輕輕晃動以清洗細胞表面1-2次;

用廢液泵吸走 PBS 廢液，加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)于培養(yǎng)瓶中，拿起培養(yǎng)皿輕輕轉動以便胰酶浸泡到每個細胞，消化 1-3min(根據(jù)細胞貼壁情況判斷，貼壁較牢的消化時間長一點或者放入 CO2 培養(yǎng)箱中消化幾分鐘)后，在顯微鏡下觀察細胞是否變圓變亮，一旦發(fā)現(xiàn)大量細胞胞質回縮，細胞間隙增大，即將脫離培養(yǎng)皿底，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

用 1ml 移液槍輕柔吹打，保證培養(yǎng)皿底的每個角落都吹打到，邊緣處也不能忽略(吹打時盡量避免產生氣泡，因其對細胞有傷害;需輕柔吹打，用力吹打對細胞也有傷害)，把培養(yǎng)瓶中所有細胞懸液用吸 1ml 移液槍移入無菌離心管中。

將裝有BT-474細胞懸液的離心管放入離心機中(配平)，1000 轉離心 3-5min，用廢液泵取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1-2mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細胞后(充分混勻)，將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻細胞(一般培養(yǎng)皿在臺子上畫 30 個 8 字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細胞。

確定BT-474細胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(盡量平直放入不要晃動)。第二天再觀察細胞密度。

BT-474人乳腺導管癌細胞凍存準備

1) 準備工作：紫外線照臺 30min，準備好BT-474細胞培養(yǎng)所需試劑物品：培養(yǎng)液，胰酶，PBS(試劑提前拿出 37℃預熱或者常溫放置半小時以上);傳代用培養(yǎng)皿，巴士管，離心管(已滅菌)，槍頭(已滅菌)，移液槍，廢液缸。檢查離心機，廢液泵;

2)從培養(yǎng)箱拿出細胞，在顯微鏡下觀察細胞密度和細胞狀態(tài)，待細胞生長狀態(tài)良好且存活率高的狀態(tài)下，細胞密度達 80–90%時，可進行細胞凍存操作，以T25 瓶為例

bt474細胞凍存步驟

a.收集BT-474細胞及細胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶內所有培養(yǎng)基轉入無菌離心管，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。

b.根據(jù)BT-474細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液， 在細胞凍存管上貼上細胞標簽(細胞標簽上包含：細胞名稱、凍存日期、培養(yǎng)用的 培養(yǎng)基)。

c.將凍存管入庫到-80 度凍存盒里，放置 24 小時后，即可移入液氮中保存，標記好入庫位置和凍存日期。

BT474細胞培養(yǎng)注意事項

bt474細胞呈島狀/片狀生長：這是該細胞的特性，是正?，F(xiàn)象，并不是細胞發(fā)生“聚團”，無需擔心。細胞間連接緊密，在70%~80%密度時細胞實際數(shù)量其實比較大了，此時需要傳代。

bt474細胞生長速度偏慢：注意控制傳代密度不要過低，否則生長速度會極慢。推薦傳代比例1:2-1:4(具體情況視細胞生長速度及密度決定)

黑點較多：bt474細胞培養(yǎng)時背景中可能有黑點，為細胞代謝產物和細胞碎片，不影響細胞生長。若黑點較多可以通過PBS潤洗或換液清除。如果黑點較多同時出現(xiàn)細胞變形、大量死亡或不生長的情況，應該考慮操作不當導致細胞受損或者存在支原體污染。

存在漂浮細胞：bt474細胞培養(yǎng)時存在部分漂浮的細胞是正常現(xiàn)象，不影響貼壁細胞生長。

BT-474人乳腺導管癌細胞培養(yǎng)常見問題

1.BT474人乳腺導管癌細胞復蘇之后貼壁很慢正常嗎?

BT474細胞復蘇后需要一定時間恢復狀態(tài)，BT474細胞貼壁較慢，消化處理后48h內盡量不要移動，以免影響貼壁，生長速度較慢，培養(yǎng)過程中，有小部分細胞會漂在培養(yǎng)基中屬于正?，F(xiàn)象。

2.BT474傳代密度多大?

BT474細胞容易抱團生長，因此不會長滿整個皿，細胞密度達70%以上即可傳代。

3.BT474細胞培養(yǎng)過程中有很多小黑點是正常的嗎?

BT474細胞培養(yǎng)過程中會有碎片和分泌物是正常的。

4.BT474細胞一分二多久長滿?

4天左右。

5.細胞呈島狀/片狀生長正常嗎？

這是BT474細胞的特性，是正常現(xiàn)象，并不是細胞發(fā)生“聚團”，無需擔心。細胞間連接緊密，在70%~80%密度時細胞實際數(shù)量其實比較大了，此時需要傳代。

6.BT474細胞生長速度偏慢？

注意控制傳代密度不要過低，否則生長速度會極慢。推薦傳代比例1:2-1:4(具體情況視細胞生長速度及密度決定)

7.BT474細胞培養(yǎng)時為什么會出現(xiàn)黑點較多的現(xiàn)象？

BT474細胞培養(yǎng)時背景中可能有黑點，為細胞代謝產物和細胞碎片，不影響細胞生長。若黑點較多可以通過PBS潤洗或換液清除。如果黑點較多同時出現(xiàn)細胞變形、大量死亡或不生長的情況，應該考慮操作不當導致細胞受損或者存在支原體污染。

8.為什么會存在漂浮細胞？

Bt474細胞培養(yǎng)時存在部分漂浮的細胞是正常現(xiàn)象，不影響貼壁細胞生長。

BT-474人乳腺導管癌細胞應用

1.PNRC多肽通過干擾核受體途徑抑制BT474細胞的增殖

目的

運用核受體輔活化子PNRC的抗Ras PTD融合多肽(PTD-PARP)研究其在乳腺癌細胞BT474中的分布,對核受體信號傳導途徑的影響及其抗腫瘤細胞增殖活性.

方法

用多肽合成儀合成PTD-PARP,單獨的PARP和PTD多肽以及FTFC標記的PTD-PARP,PARP.HPLC分析和純化后,熒光顯微鏡結合流式細胞儀檢測PTD-PARP,PARP在BT474細胞中的分布.蟲熒光素酶報告基因檢測PTD-PARP對野生型PNRC輔活化ER反式激活功能的影響.MTS,軟瓊脂克隆形成實驗檢測PTD-PARP對BT474細胞的抗增殖活性.

結果

PTD-PARP能進入BT474細胞,抑制野生型PNRC輔活化ER的反式激活功能并抑制BT474細胞的增殖.

結論

PNRC抗RasP DT融合多肽可通過干擾核受體途徑抑制乳腺癌細胞的增殖.

2.用于藏藥毛訶子化學成分及體外抗癌活性的研究

總結了沒食子酸及其酚酸類衍生物、鞣花酸及其酚酸類衍生物、可水解鞣質的質譜解析規(guī)律。采用CellTiter-Blue?Cell Viability Assay法,對藏藥毛訶子不同極性萃取部位的抗癌活性進行初步評價。

選用人乳腺導管癌細胞(ZR 75-1)、人乳腺導管癌細胞(BT-474)、人乳腺癌細胞(MCF-7)、人乳腺癌細胞(T-47D)、人結腸直腸腺癌細胞(Colo-205)、人結腸腺癌細胞(HT-29)、人結腸癌細胞(SW480)、人子宮內膜腺癌細胞(Hec-1-A)、人前列腺癌細胞(LnCap)和人神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)10種癌細胞為模型,比較藏藥毛訶子不同極性部位的抗癌活性,結果表明,藏藥毛訶子乙酸乙酯萃取部位和水萃取部位抗癌活性較強,乙酸乙酯萃取部位對ZR 75-1、Colo-205、BT-474和T-47D癌細胞的抑制作用最為明顯,其半數(shù)抑制濃度IC50分別為27.33μg/mL、36.63μg/mL、5 0.67μg/mL和53.47μg/mL;

水萃取部位對T-47D和Colo-205癌細胞的抑制作用最為明顯,其半數(shù)抑制濃度IC50分別為35.98μg/mL和55.17μg/mL。

選用人乳腺導管癌細胞(ZR75-1)和人結腸直腸腺癌細胞(Colo-205)為模型,對乙酸乙酯萃取部位分離得到的21個單體化合物進行抗癌活性篩選,結果表明訶,子寧、訶子酸、安石榴苷、柯里拉京、五沒食子酰葡糖苷5個單體對ZR75-1癌細胞增殖有較強的抑制作用,且半數(shù)抑制濃度IC50分別為6.31 mM、7.48 mM、7.95mM、7.71 mM、25.23 mM;

訶子寧、訶子酸、安石榴苷、柯里拉京4個單體對Colo-205癌細胞增殖有較強的抑制作用,且半數(shù)抑制濃度IC50分別為6.04 mM、19.69mM、10.88 mM、7.58 mM。采用Annexin V-FITC/PI雙標記法及流式細胞術研究檢測乙酸乙酯萃取部位對其較為敏感的人乳腺導管癌細胞(ZR75-1)和人結腸直腸腺癌細胞(Colo-205)凋亡的影響,結果表明,毛訶子乙酸乙酯部位作用72 h對ZR75-1和Colo-205細胞具有顯著的誘導凋亡作用,且隨著藥物濃度的增加,細胞總凋亡率逐漸上升。

bt474細胞參考文獻

[1]Distribution of Metabolites in Root Barks of Seven Tree Peony Cultivars for Quality Assessment Using NMR-based Metabolomics[J].Pei Wang,Ze-ming Rong,Cui-xia Ma,Xin-feng Zhao,Chao-ni Xiao,Xiao-hui Zheng.Chinese Herbal Medicines.2017(1)

[2]Ellagitannin oligomers and a neolignan from pomegranate arils and their inhibitory effects on the formation of advanced glycation end products[J].Hideyuki Ito,Peng Li,Mayuko Koreishi,Akifumi Nagatomo,Norihisa Nishida,Takashi Yoshida.Food Chemistry.2014

[3]Anti-Helicobacter pylori compounds from the ethanol extracts of Geranium wilfordii[J].Xi-Quan Zhang,Hong-Mei Gu,Xin-Zhu Li,Zhong-Nan Xu,Yu-Sheng Chen,Yang Li.Journal of Ethnopharmacology.2013(1)

[4]TLC Densitometric Methods for Quantification of Gallic Acid in Triphala Churna for Routine Quality Control[J].Vishal Jain,Ambar Vyas,Swarnlata Saraf,S.Saraf.Research Journal of Pharmacy and Technology.2011(2)

[5]李師.藏藥毛訶子化學成分及體外抗癌活性的研究[D].北京中醫(yī)藥大學,2018.

Lasfargues EY, et al. Isolation of two human tumor epithelial cell lines from solid breast carcinomas. J. Natl. Cancer Inst. 61: 967-978, 1978. PubMed: 212572
 
Lasfargues EY, et al. A human breast tumor cell line (BT-474) that supports mouse mammary tumor virus replication. In Vitro 15: 723-729, 1979. PubMed: 94035
 
Littlewood-Evans AJ, et al. The osteoclast-associated protease cathepsin K is expressed in human breast carcinoma. Cancer Res. 57: 5386-5390, 1997. PubMed: 9393764
 
The cells form adherent patches of epithelial-like cells The patches are compact multilayered colonies that rarely become confluent
 
Lasfargues EY, et al. Isolation of two human tumor epithelial cell lines from solid breast carcinomas. J. Natl. Cancer Inst. 61: 967-978, 1978. PubMed: 212572