HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞介紹

HT-29是一種具有上皮形態(tài)的細(xì)胞系，于1964年從一名患有結(jié)腸直腸腺癌的44歲白人女性患者的原發(fā)性腫瘤中分離得到。

HT-29細(xì)胞系是合適的轉(zhuǎn)染宿主，可用于癌癥和毒理學(xué)研究。近來，已建株的培養(yǎng)細(xì)胞用含血清McCoy’s 5A培液培養(yǎng)。該細(xì)胞系在裸鼠中致瘤，也能在類固醇處理的地鼠中致瘤。

HT-29細(xì)胞合成IgA、CEA、TGFβ結(jié)合蛋白和黏液素等;表達(dá)尿激酶受體，但沒有檢測到血漿酶原活性;不表達(dá)CD4，但細(xì)胞表面表達(dá)半乳糖神經(jīng)酰胺(HIV的可能替代受體)。HT-29細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特征包括微絨毛、微絲、帶有深色顆粒的大空泡線粒體、帶有游離核糖體的光滑粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、脂滴、少量初級溶酶體和許多次級溶酶體。細(xì)胞表達(dá)尿激酶受體，但不具有可檢測的纖溶酶原激活活性。HT-29細(xì)胞CD4呈陰性，但細(xì)胞表面存在半乳糖神經(jīng)酰胺(一種可能的HIV替代受體)的表達(dá)。HT-29細(xì)胞c-myc、K-ras、H-ras、N-ras、Myb、sis和fos癌基因表達(dá)陽性，但未檢測到N-myc癌基因表達(dá)，p53抗原過度產(chǎn)生，p53基因的密碼子273存在G->a突變，導(dǎo)致Arg->His取代。HT-29細(xì)胞可以用于3D細(xì)胞培養(yǎng)、高通量篩選、癌癥研究和毒理學(xué)研究，也是一種合適的轉(zhuǎn)染宿主。

HT-29細(xì)胞是一種重要的人類結(jié)直腸腺癌細(xì)胞系，具有良好的增殖能力和一定的惡性轉(zhuǎn)化特征，被廣泛用于癌癥研究領(lǐng)域。HT-29細(xì)胞被證實(shí)是一種腫瘤腺樣細(xì)胞，具有腸道上皮細(xì)胞的形態(tài)和功能特征。研究者通過探索HT-29細(xì)胞的生長特點(diǎn)、調(diào)控機(jī)制和應(yīng)用前景，為癌癥研究和治療提供了有益的信息和思路。

HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞形態(tài)特征

HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞產(chǎn)品信息

細(xì)胞名稱：HT-29，人結(jié)腸癌細(xì)胞

細(xì)胞別稱：HT 29; HT-29;HT-29;人結(jié)腸癌細(xì)胞

年齡性別：女；44歲

組織來源：結(jié)腸

形態(tài)特性：貼壁生長，上皮細(xì)胞樣

染色體：64~69

倍增時間：~36-60 hours

致瘤性：Yes, in nude mice; forms well differentiated adenocarcinoma consistent with colonic primary (grade I); tumors also form in steroid treated hamsters.

受體表達(dá)情況：human adrenergic alpha2A, urokinase receptor (u-PAR), vitamin D (moderate expression), urokinase receptor (u-PAR); vitamin D (moderate expression), human adrenergic alpha2A

基因表達(dá)情況：secretory component of IgA; carcinoembryonic antigen (CEA); transforming growth factor beta binding protein; mucin, myc+; ras+; myb+; fos+; sis+; p53+; abl -; ros -; src -, Blood Type A; Rh+; HLA A1, A3, B12, B17, Cw5, HT-29 cells are negative for CD4, but there is cell surface expression of galactose ceramide (a possible alternative receptor for HIV).

保藏機(jī)構(gòu)：ATCC; HTB-38 BCRJ; 0111 CCLV; CCLV-RIE 0960 DSMZ; ACC-299 ECACC; 91072201;中國典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞庫

培養(yǎng)基：90%5A+10% FBS+PS

培養(yǎng)條件：氣相：95%空氣+5%二氧化碳;溫度：37℃

凍存條件：無血清凍存液，液氮儲存

HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)操作說明

細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件

實(shí)驗(yàn)室條件

1. 無菌環(huán)境：無菌室包括更衣室，緩沖間，風(fēng)淋間，操作間

2. 儀器設(shè)備：超凈工作臺-操作平臺、CO2 培養(yǎng)箱-細(xì)胞生長的環(huán)境、倒置顯微鏡-觀察細(xì)胞、離心機(jī)-離心收集細(xì)胞、冰箱-放置培養(yǎng)基等試劑、水浴鍋-復(fù)蘇細(xì)胞、真空泵-收集廢液、滅菌鍋-滅菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-凍存細(xì)胞、純水儀-制備一級水

3. 器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭(白色 0-10ul;黃色 20-200ul;藍(lán)色 100-1000ul)、濾器，吸管，多孔培養(yǎng)皿、6cm 皿、10cm 皿，培養(yǎng)瓶等。

4. 試劑：5A培養(yǎng)基、FBS胎牛血清、雙抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)、pbs

操作者工作范疇

1. 無菌操作：洗手，戴手套，穿實(shí)驗(yàn)服，常噴 75%酒精

HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞復(fù)蘇步驟

1.準(zhǔn)備：紫外線照臺 30min，提前打開水浴鍋設(shè)置 37℃，培養(yǎng)基臨用前放水浴箱里溫育20 分鐘(或者放在超凈工作臺常溫放 30min)。在操作臺上擺放好物品，左邊放完全培養(yǎng)液，1mL 槍頭(已滅菌)，培養(yǎng)皿，右上角放廢液缸，1mL 移液槍，3mL 巴氏管。檢查離心機(jī)，廢液泵。

2)待水浴鍋溫度達(dá)到 37℃時，戴上手套和護(hù)目鏡，從-196℃液氮罐中取出凍存管，將含有1 mLHT-29細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，同時不斷輕輕搖動凍存管，盡量保證凍存管內(nèi)細(xì)胞 1min 內(nèi)融化，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻， 移入離心機(jī)中 100rpm 離心 3min，以 75%酒精噴凍存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。

3)用 3mL 巴氏管取 5mL 新鮮培養(yǎng)基到一個新的 6cm 培養(yǎng)皿中，(若離心后HT29細(xì)胞量較多，可取 12mL 新鮮培養(yǎng)基到一個新的 10cm 培養(yǎng)皿中)，標(biāo)記日期、所用培養(yǎng)基名稱和細(xì)胞名稱。

4)用廢液泵(吸力不要太大)取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后(充分混勻)，將HT-29細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻細(xì)胞(一般培養(yǎng)皿在臺子上畫 30 個 8 字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻HT29細(xì)胞。

5)確定細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱過夜。(盡量平直放入不要晃動)，第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞傳代操作

1.從培養(yǎng)箱拿出細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)良好，且密度達(dá)到 85%左右的時候即可進(jìn)行傳代;

2.打開廢液泵，用廢液泵吸頭(吸力不要太大)取一個藍(lán)色槍頭吸走上清廢液，用巴士管取 4ml 不含鈣、鎂離子的1xPBS(6cm 皿)到細(xì)胞培養(yǎng)皿中(若是 10cm 皿則取 8ml 1xPBS)，輕輕晃動以清洗HT-29細(xì)胞表面1-2次;

3.用廢液泵吸走 PBS 廢液，加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)于培養(yǎng)瓶中，拿起培養(yǎng)皿輕輕轉(zhuǎn)動以便胰酶浸泡到每個細(xì)胞，消化 1-3min(根據(jù)細(xì)胞貼壁情況判斷，貼壁較牢的消化時間長一點(diǎn)或者放入 CO2 培養(yǎng)箱中消化幾分鐘)后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓變亮，一旦發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大，即將脫離培養(yǎng)皿底，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

4.用 1ml 移液槍輕柔吹打，保證培養(yǎng)皿底的每個角落都吹打到，邊緣處也不能忽略(吹打時盡量避免產(chǎn)生氣泡，因其對細(xì)胞有傷害;需輕柔吹打，用力吹打?qū)?xì)胞也有傷害)，把培養(yǎng)瓶中所有細(xì)胞懸液用吸 1ml 移液槍移入無菌離心管中。

5.將裝有HT-29細(xì)胞懸液的離心管放入離心機(jī)中(配平)，1000 轉(zhuǎn)離心 3-5min，用廢液泵取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1-2mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后(充分混勻)，將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻細(xì)胞(一般培養(yǎng)皿在臺子上畫 30 個 8 字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細(xì)胞。

6.確定細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(盡量平直放入不要晃動)。第二天再觀察細(xì)胞密度。

HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞凍存操作

從培養(yǎng)箱拿出細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞生長狀態(tài)良好且存活率高的狀態(tài)下，HT-29細(xì)胞密度達(dá) 80–90%時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存操作，以T25 瓶為例

a.收集HT-29細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶內(nèi)所有培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌離心管，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b.根據(jù)HT-29細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液， 在細(xì)胞凍存管上貼上細(xì)胞標(biāo)簽(細(xì)胞標(biāo)簽上包含：細(xì)胞名稱、凍存日期、培養(yǎng)用的 培養(yǎng)基)。

c.將凍存管入庫到-80 度凍存盒里，放置 24 小時后，即可移入液氮中保存，標(biāo)記好入庫位置和凍存日期。

HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)常見問題

ht29細(xì)胞用什么培養(yǎng)基

ht29細(xì)胞培養(yǎng)基90%5A+10% FBS+PS

如何養(yǎng)好HT29細(xì)胞

a..降低傳代密度，當(dāng)ht29細(xì)胞融合度70%-75%左右就可進(jìn)行傳代。

b.傳代后24-48小時內(nèi)不要移動。

c.消化時，不要反復(fù)晃動培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，可培養(yǎng)箱內(nèi)靜置消化，否則細(xì)胞會呈屑樣脫落，不利于消化成單顆細(xì)胞。

d.ht29細(xì)胞生長時，會有少量漂浮細(xì)胞碎片，背景可見少量黑點(diǎn)，是正?，F(xiàn)象，不要過度清洗，隨著換液和傳達(dá)可暫時改善，但繼續(xù)培養(yǎng)無法避免。

HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞的特點(diǎn)

1. HT-29細(xì)胞在培養(yǎng)基中呈現(xiàn)出貼壁生長的特點(diǎn)，并且具有較高的增殖能力。這些細(xì)胞形態(tài)上呈現(xiàn)為不規(guī)則形態(tài)，細(xì)胞核較大且異型性較高。HT-29細(xì)胞對多種細(xì)胞因子和生長因子的反應(yīng)較為敏感，能夠在不同因子的刺激下快速增殖。

2. 隨著貼壁時間延長，HT-29細(xì)胞形態(tài)有很大變化，從剛開始的亮亮圓圓的單顆細(xì)胞，到呈片生長的上皮樣。

3. HT-29細(xì)胞貼壁48h后呈島狀聚集生長，當(dāng)細(xì)胞密度較大時，不易消化并易成團(tuán)。所以控制消化時間尤為重要，消化時間過短，細(xì)胞不易從瓶壁脫落，吹打過度，導(dǎo)致細(xì)胞碎裂，碎片過多;消化過度，導(dǎo)致細(xì)胞傳代后漂浮增多。

HT-29細(xì)胞和caco2細(xì)胞的區(qū)別

1. 來源不同

HT-29來自人類大腸癌的原發(fā)灶;而Caco2來自人類結(jié)腸腺癌的轉(zhuǎn)移灶。

2. 增殖率不同

HT-29細(xì)胞生長較慢，繁殖周期長;而Caco2細(xì)胞生長較快，繁殖周期短。

3. 細(xì)胞形態(tài)不同

HT-29細(xì)胞在培養(yǎng)條件下呈現(xiàn)懸浮生長狀態(tài);而Caco2細(xì)胞則呈現(xiàn)附著狀態(tài)，形態(tài)較為扁平。

HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞應(yīng)用

HT29 細(xì)胞是一種來源于人類結(jié)直腸腺癌的細(xì)胞系，被廣泛用于癌癥研究領(lǐng)域。這種細(xì)胞系最初于1964年由Herbert Taylor 教授和J Howard Bez51 歲的男性病人的原發(fā)結(jié)腸癌組織中分離和建立。HT29細(xì)胞被證實(shí)是一種腫瘤腺樣細(xì)胞，具有腸道上皮細(xì)胞的形態(tài)和功能特征。

HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞的生長調(diào)控機(jī)制

HT-29細(xì)胞的生長受到多種因素的調(diào)控，包括細(xì)胞因子的刺激、信號傳導(dǎo)通路的激活等。研究者通過調(diào)控HT-29細(xì)胞的生長環(huán)境或使用特定的藥物，可以影響其增殖和轉(zhuǎn)化能力，從而為癌癥治療提供理論依據(jù)。

HT-29細(xì)胞在癌癥研究中的應(yīng)用

由于HT-29細(xì)胞具有良好的增殖能力和一定的惡性轉(zhuǎn)化特征，因此被廣泛應(yīng)用在癌癥研究領(lǐng)域。研究者利用HT-29細(xì)胞模擬腸道腫瘤生長過程，探討癌細(xì)胞的生長規(guī)律、侵襲能力以及對藥物的敏感性等問題。

HT-29可以用于基于EMT探討重樓對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用機(jī)制

選取重樓及其單體,旨在探討通過調(diào)控EMT,抑制結(jié)直腸癌遷移和侵襲的作用機(jī)制,闡明其對結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的抑制作用,為藥物靶向作用于結(jié)直癌的轉(zhuǎn)移提供實(shí)驗(yàn)支持,并為控制結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移提供新的思路與方法。

方法

(1)培養(yǎng)人結(jié)直腸癌HT-29和LoVo細(xì)胞株。

(2) MTT法檢測不同濃度的藥物對HT-29和LoVo細(xì)胞活力的影響,分析藥物的IC50值;篩選并選取重樓最敏感單體進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

(3) 平板克隆和Ed U增殖實(shí)驗(yàn)檢測藥物對細(xì)胞增殖作用的影響;Western-blotting檢測藥物干預(yù)后PI3K/Akt信號通路的蛋白表達(dá)。

(4) Transwell檢測藥物對細(xì)胞遷移、侵襲的影響;Western-blotting檢測藥物干預(yù)后EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)。

結(jié)果

(1)人結(jié)腸癌HT-29和LoVo細(xì)胞生長良好,適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

(2) MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PPE對HT-29和LoVo細(xì)胞生長具有抑制作用,并且呈濃度相關(guān)性。

(3) 平板克隆和Ed U增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PPE對細(xì)胞增殖有抑制作用。

(4) Western-blotting檢測PI3K/Akt相關(guān)蛋白表達(dá),結(jié)果表明,PPE干預(yù)細(xì)胞后,與對照組相比,p-PI3K、p-Akt表達(dá)水平降低。

(5) Transwell結(jié)果表示,PPE抑制細(xì)胞的遷移和侵襲。

(6) Western-blotting檢測EMT相關(guān)蛋白,結(jié)果表明,PPE干預(yù)細(xì)胞后,與對照組相比,E-cadherin表達(dá)水平增加,N-cadherin、MMP2、MMP9表達(dá)水平降低,Smad2、Smad3表達(dá)基本不變,p-Smad2、p-Smad3表達(dá)水平降低。

(7) 重樓內(nèi)重樓皂苷Ⅰ(PPI)、重樓皂苷Ⅱ(PPII)、重樓皂苷VII(PPVII)的含量為檢測重樓的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),MTT結(jié)果顯示PPI、PPII、PPVII對細(xì)胞活力均具有抑制作用,但PPVII對細(xì)胞活力抑制最明顯,故選擇PPVII進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

(8) 平板克隆和Ed U增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PPVII對細(xì)胞增殖有抑制作用。

(9) Western-blotting檢測PI3K/Akt相關(guān)蛋白表達(dá),結(jié)果表明,PPVII干預(yù)細(xì)胞后,與對照組相比,p-PI3K、p-Akt表達(dá)水平降低。

(10) Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示,PPVII抑制細(xì)胞的遷移和侵襲。

(11) Western-blotting檢測EMT相關(guān)蛋白,結(jié)果表明,PPVII干預(yù)細(xì)胞后,與對照組相比,E-cadherin表達(dá)水平增加,N-cadherin、MMP2、MMP9表達(dá)水平降低,Smad2、Smad3表達(dá)基本不變,p-Smad2、p-Smad3表達(dá)水平降低。

結(jié)論

重樓通過體外實(shí)驗(yàn)研究表現(xiàn)出了一定的抗癌活性,其機(jī)制可能與PPVII通過調(diào)控PI3K、Akt的磷酸化水平抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖,調(diào)控Smad2、Smad3磷酸化水平調(diào)控EMT過程,從而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲,為重樓皂苷靶向治療結(jié)直腸癌提供實(shí)驗(yàn)支持。

結(jié)語

HT29 細(xì)胞是一種重要的人類結(jié)直腸腺癌細(xì)胞系，具有良好的增殖能力和一定的惡性轉(zhuǎn)化特征，被廣泛用于癌癥研究領(lǐng)域。研究者通過探索HT29細(xì)胞的生長特點(diǎn)、調(diào)控機(jī)制和應(yīng)用前景，為癌癥研究和治療提供了有益的信息和思路。HT29細(xì)胞的研究將進(jìn)一步推動癌癥領(lǐng)域的發(fā)展，為人類健康作出貢獻(xiàn)。

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