今天推薦的是由漢諾威醫(yī)學(xué)院神經(jīng)解剖研究所在2010年2月23日發(fā)表于Cell and Tissue Research(2021IF：3.5999，JCRQ1)的一篇文章，通訊作者是Claudia Grothe教授，研究表明用SV40大T抗原永生化的大鼠腹側(cè)間腦神經(jīng)元祖細(xì)胞的特征和分化潛能。

研究背景

神經(jīng)元祖細(xì)胞(NPC)在再生醫(yī)學(xué)中具有很大的應(yīng)用潛力。為了克服其有限的有絲分裂能力，人們采用了各種永生化策略，使其能夠在體外長期保持和擴增。這種永生化細(xì)胞可用于設(shè)計和發(fā)現(xiàn)治療神經(jīng)退行性疾病(如帕金森病)的新細(xì)胞療法。

摘要部分

研究人員利用SV40大T抗原(SV40Tag)永生了大鼠腹側(cè)間腦NPCs。與原代細(xì)胞相比，所有克隆細(xì)胞的增殖率都高出兩到三倍。為了誘導(dǎo)所生成細(xì)胞克隆的多巴胺能分化，應(yīng)用了膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和二丁烯環(huán)磷酸腺苷。然后對處理過的細(xì)胞進行表征，包括多巴胺能系標(biāo)志物的表達、各種細(xì)胞群的分化、在凱因酸鹽存在下的鈣成像以及葉內(nèi)移植后的免疫組化。經(jīng)處理的細(xì)胞顯示出形態(tài)成熟，鈣成像顯示出在凱氏酸鹽存在下的神經(jīng)元特性。這些細(xì)胞還表達了低水平的多巴胺轉(zhuǎn)運體和酪氨酸羥化酶(TH)mRNA，但沒有發(fā)現(xiàn)TH免疫陽性神經(jīng)元。將神經(jīng)細(xì)胞移植到神經(jīng)毒素缺失的大鼠體內(nèi)并不能誘導(dǎo)其進一步分化。作為一種替代方法，研究人員用si RNA沉默了SV40Tag，但這并不足以引發(fā)多巴胺能神經(jīng)元的分化。不過，從β-tubulin III型和膠質(zhì)纖維酸性蛋白染色中可以分別檢測到神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。SV40Tag細(xì)胞適用于進行可控的基因修飾，這體現(xiàn)在高效的非病毒轉(zhuǎn)染后過表達了增強的綠色熒光蛋白。

材料方法

1. 永生化大鼠VM-NPC克隆的生成和表征

按照Timmer等人的方法培養(yǎng)從E12大鼠胚胎中制備的VM祖細(xì)胞。在增殖條件下培養(yǎng)3天后，用pSV3-neo核轉(zhuǎn)染細(xì)胞以表達SV40Tag。在G418選擇條件下培養(yǎng)2周后，通過稀釋獲得克隆。從四個SV40Tag細(xì)胞克隆(C1、C2、C3和C4)中分離出的細(xì)胞DNA顯示，除了高分子基因組DNA外，還有兩條從成年大鼠中分離出的對照基因組DNA制備中不存在的條帶。由于這些條帶的大小比pSV3-neo質(zhì)粒小得多，因此這些條帶很可能是重組質(zhì)粒。這種染色體外復(fù)制的DNA以前在用pSV3-neo質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中也有報道。通過定量PCR將細(xì)胞DNA數(shù)量與單拷貝基因BDNF進行歸一化，發(fā)現(xiàn)C1、C2和C4株系中SV40Tag序列的數(shù)量相似，而C3株系中SV40Tag序列的數(shù)量僅為C1、C2和C4株系的一半。半定量RT-PCR顯示SV40Tag mRNA的表達水平相似(圖1a)，Western印跡分析顯示所有四個細(xì)胞克隆中都存在SV40Tag蛋白(90kDA)(圖1b)。此外，免疫細(xì)胞化學(xué)染色法在體外永生化細(xì)胞克隆的培養(yǎng)液中(圖1，c'-f')和移植到帕金森大鼠模型體內(nèi)后檢測到了SV40Tag。在成功生成各種SV40Tag細(xì)胞克隆后，研究人員接下來檢測了它們的增殖活性。研究人員使用WST-1試驗評估了倍增時間。與原代VME12細(xì)胞相比，所有分析的細(xì)胞克隆的倍增時間都縮短了兩到三倍(圖2a)。永生化細(xì)胞克隆的倍增時間在13到18小時之間，而原代E12細(xì)胞的倍增時間為47小時。

利用半定量RT-PCR對轉(zhuǎn)錄因子和其他與DA分化相關(guān)的分子(表1)進行了表征。在增殖和分化條件下對原代間腦培養(yǎng)物和永生化細(xì)胞克隆進行了分析。在增殖條件下觀察2天和4天后，在分化條件下觀察2天和5天后，可觀察到原始間腦祖細(xì)胞的特征圖譜(圖2b)，包括Pax2、Lmx1b、Wnt1、Wnt5a、Nurr1、Dlk1、En1、Pitx3、Ngn2、DAT和TH的表達。在分化條件下，可以看到原代細(xì)胞中Pitx3、DAT和TH等末端標(biāo)志物的表達水平升高(圖2b)。接下來，研究人員分析了經(jīng)過短期培養(yǎng)(在粘附培養(yǎng)基中培養(yǎng)1天，在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天)后永生化的SV40Tag克隆。關(guān)于參與向DA神經(jīng)元規(guī)范化和早期分化的基因，四個克隆中有三個(C2、C3和C4)顯示出與原代VM培養(yǎng)物相似的特征(圖2c)，如Lmx1b、Wnt1、Wnt5a、Nurr1、En1和Dlk1的表達。然而，既沒有檢測到Ngn2的表達，也沒有檢測到Pitx3、TH和DAT等終末分化標(biāo)記物的表達(數(shù)據(jù)未顯示)。僅在C1和C3中觀察到Pax2的表達。在這些條件下，細(xì)胞在形態(tài)上仍處于未分化狀態(tài)，免疫細(xì)胞化學(xué)也證明了這一點，免疫細(xì)胞化學(xué)既沒有發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞(β-tubulinIII型)，也沒有發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)，而所有細(xì)胞都有nestin免疫反應(yīng)(圖1c-f)。

圖1.在生成的細(xì)胞克隆

圖2.對生成的SV40Tag-immortalized細(xì)胞克隆進行表征

研究結(jié)論：永生化大鼠VM-NPC克隆的生成和表征，SV40Tag間腦細(xì)胞克隆表達DA神經(jīng)元規(guī)格化和早期分化的標(biāo)志物。

2. 間腦細(xì)胞克隆的分化潛能

誘導(dǎo)所選克隆進一步分化的第一種嘗試是引入編碼SV40TagshRNA的載體，以實現(xiàn)對SV40Tag表達的沉默。只有一個細(xì)胞克隆(C1)在嘌呤霉素選擇下轉(zhuǎn)染6天后，通過Western印跡和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測SV40Tag，成功實現(xiàn)了沉默(圖3a-c)。在適合原代祖細(xì)胞的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)未能觸發(fā)DA分化(即TH免疫反應(yīng)，數(shù)據(jù)未顯示)。然而，隨著時間的推移，沉默導(dǎo)致C1中的β-微管蛋白III型細(xì)胞數(shù)量增加(圖3d、f)，并且在這些條件下發(fā)生了神經(jīng)膠質(zhì)分化，因為12天后發(fā)現(xiàn)了具有GFAP免疫活性的細(xì)胞(圖3e)。此外，研究人員還可以觀察到一些細(xì)胞中的nestin免疫活性下降(圖3g，箭頭)。第二種分化方法是將永生化細(xì)胞克隆(C2和C3)在cAMP和GDNF存在下培養(yǎng)12天。經(jīng)nestin免疫染色(圖4c-f)和相位對比分析(圖4a、b)后，觀察到cAMP/GDNF處理細(xì)胞與未處理細(xì)胞的形態(tài)差異，特別是神經(jīng)元的生長。只有在cAMP和GDNF處理的細(xì)胞中才發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)元的進一步分化(以β-微管蛋白III型免疫反應(yīng)為標(biāo)志)(圖4g、h、g'、h')。有趣的是，通過評估涉及DA神經(jīng)發(fā)生的各種基因的表達，發(fā)現(xiàn)一個細(xì)胞克隆(C2)顯示出與原代祖細(xì)胞相似的表達模式，包括在這些條件下Pitx3、DAT和TH的表達(圖4i)。將分化3天后C2和C3的表達譜(圖2c)與分化12天后的表達譜(圖4i)進行比較，還觀察到其他差異。分化3天后在C3中檢測到的Pax2表達在分化12天后消失。相反，3天后在任何細(xì)胞克隆中都未檢測到Ngn2的表達(數(shù)據(jù)未顯示);但在分化12天后，在C2和C3克隆中都觀察到了Ngn2的表達，在cAMP/GDNF處理的培養(yǎng)物中，Ngn2的表達水平升高(圖4i)。其他嘗試，如兩種方法(SV40沉默和cAMP/GDNF處理)的結(jié)合或應(yīng)用更高濃度的FCS或不同量的Forskolin和BDNF，都沒有導(dǎo)致SV40Tag細(xì)胞的DA分化。

使用Fura-2熒光鈣成像技術(shù)檢測cAMP和GDNF處理的C2細(xì)胞中的鈣瞬態(tài)。該方法用于獲取神經(jīng)元分化及其時間過程的功能信息。第一步，用不含激動劑的細(xì)胞外溶液進行記錄，檢測細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的自發(fā)瞬態(tài)，作為鈣滲透性突觸谷氨酸受體(即神經(jīng)元分化的標(biāo)志)表達的功能相關(guān)性，并追蹤突觸接觸的建立。研究人員沒有在這些NPC中檢測到自發(fā)出現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)鈣信號。然而，對離子型α-氨基-3-羥基-5-甲基異惡唑-4-丙酸(AMPA)/KA-型谷氨酸受體施加100μMKA(一種非脫敏激動劑)2秒脈沖后，可再現(xiàn)鈣瞬態(tài)，細(xì)胞內(nèi)鈣平均增加(75.45±5.46 nM，圖4j)。細(xì)胞外鈣(3.2 mM)是出現(xiàn)這種鈣信號的先決條件。因此，可以推測鈣流入了記錄的NPC。鈣濃度在2.3±0.41秒內(nèi)衰減至峰值的1/3。所有記錄到的鈣瞬態(tài)點都能完全衰減至基線，這表明細(xì)胞具有足夠的鈣緩沖能力。這些數(shù)據(jù)揭示了KA調(diào)節(jié)的鈣離子滲透谷氨酸受體的膜表達。

圖3.用編碼SV40Tag shRNA的質(zhì)粒pSUPER.puro轉(zhuǎn)染可抑制SV40免疫反應(yīng)

圖4.應(yīng)用cAMP和GDNF后的分化

研究結(jié)論：進一步研究了細(xì)胞克隆在兩種不同條件下的分化潛能。

3. 鑒定腦室內(nèi)移植后的SV40Tag-immortalized細(xì)胞

將SV40Tag克隆C1和C2移植到6-OHDA病損大鼠腦內(nèi)后，對冠狀腦切片進行SV40Tag抗原、神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物以及nestin表達的免疫組織化學(xué)分析?？寺?轉(zhuǎn)染后在粘附培養(yǎng)基中培養(yǎng)1天，在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天。將1 μl中含有200,000個細(xì)胞的4個沉積物分別移植到6-OHDA病變大鼠的紋狀體中。移植后7天，移植物中發(fā)現(xiàn)SV40免疫反應(yīng)(圖5a、b)。進一步的免疫組化分析顯示，移植體中存在巢蛋白和GFAP陽性的細(xì)胞群(圖5c、e)。移植體中GFAP免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞的數(shù)量相對較少(圖5c、e，箭頭)，這與體外研究獲得的數(shù)據(jù)一致。與移植物周圍的GFAP和nestin標(biāo)記細(xì)胞相比，這些細(xì)胞顯示出不同的形態(tài);它們很可能是宿主組織形成的膠質(zhì)瘢痕中的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞(圖5e)。此外，在移植物內(nèi)還發(fā)現(xiàn)了對β-微管蛋白III型呈陽性反應(yīng)的神經(jīng)元(圖5g);但沒有檢測到TH免疫反應(yīng)細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)。雖然C2細(xì)胞在體外經(jīng)過12天的cAMP/GDNF處理后可誘導(dǎo)神經(jīng)元分化，但將這些細(xì)胞移植到神經(jīng)毒素缺損的大鼠體內(nèi)并沒有增加移植物內(nèi)的神經(jīng)元數(shù)量(數(shù)據(jù)未顯示)。

圖5.鑒定SV40Tag-immortalized細(xì)胞產(chǎn)后移植

研究結(jié)論：鑒定了SV40Tag-immortalized細(xì)胞的產(chǎn)后移植。

4. 將基因高效轉(zhuǎn)入SV40Tag-immortalized間腦細(xì)胞

用pCAGGS-EGFP表達載體核轉(zhuǎn)染和/或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染原代和SV40Tag-immortalized間腦細(xì)胞。為了估算兩種方法的轉(zhuǎn)染效率，計算了EGFP熒光細(xì)胞數(shù)與DAPI陽性細(xì)胞數(shù)的比率(圖6a、b)。值得注意的是，這兩種方法對永生化細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率相似，都約為60%，而原代細(xì)胞的核轉(zhuǎn)染效率為47%(圖6c)。

此外，如初步實驗所示，SV40Tag細(xì)胞單層適合與原代祖細(xì)胞(分化條件下分化前5天的E12VM細(xì)胞)進行共培養(yǎng)實驗(圖7)。分化成DA神經(jīng)元(TH陽性)的原代細(xì)胞成簇分布(圖7a、b)。有趣的是，神經(jīng)球內(nèi)沒有SV40Tag陽性細(xì)胞(圖7c，d)。

圖6.將基因高效轉(zhuǎn)移到SV40Tag-immortalizedVM細(xì)胞中

圖7.原代VM與SV40Tag-immortalized細(xì)胞的共培養(yǎng)

研究結(jié)論：將基因高效轉(zhuǎn)入SV40Tag-immortalized間腦細(xì)胞

結(jié)論與討論

總之，盡管生產(chǎn)用于實驗和治療的持久性DA神經(jīng)元來源的目標(biāo)尚未實現(xiàn)，但這些永生化細(xì)胞克隆的實驗證明了它們的多能特性，因為這些細(xì)胞(1)在特定條件下可分化為神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞類型，分別顯示出GFAP和β-微管蛋白III型免疫反應(yīng);(2)表達涉及DA神經(jīng)元神經(jīng)發(fā)生的關(guān)鍵基因的mRNA;(3)表達鈣離子滲透性AMPA受體，調(diào)節(jié)完整的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，因此能夠經(jīng)歷進一步的發(fā)育過程。此外，所生成的細(xì)胞克隆可用作研究DA表型的規(guī)格化和分化過程中發(fā)生的分子事件的模型，也可用于進行受控遺傳修飾，包括神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)或其他與DA細(xì)胞分化、維持和功能相關(guān)的活性化合物的過度表達。最后，本報告為研究體外VM多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育和生理學(xué)的永生化方法的文獻增添了有用的信息。