THP-1細(xì)胞背景介紹

THP-1人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系是1980年Tsuchiya等人建立的人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系。它來自一位急性單核細(xì)胞白血病患者的血液，有分化為多種巨噬細(xì)胞的能力，是各領(lǐng)域研究常用的細(xì)胞系之一。

THP-1是人外周血的單核細(xì)胞系，最初來源于急性單核細(xì)胞性白血病患者。屬于懸浮細(xì)胞，適合用于轉(zhuǎn)染或感染實驗。其表面抗原HLA型為：A2，A9，B5，DRw1，DRw2。

THP-1細(xì)胞形態(tài)

ATCC細(xì)胞庫THP-1細(xì)胞圖片

逸漠細(xì)胞庫THP-1細(xì)胞圖片

THP-1細(xì)胞的特點

1.THP-1細(xì)胞為懸浮生長，部分細(xì)胞聚集成團，部分細(xì)胞分散。

2.THP-1細(xì)胞喜歡酸性環(huán)境

在偏酸性環(huán)境中，THP-1生長更快，所以當(dāng)培養(yǎng)基稍微變黃(呈橘紅色)時，是適合細(xì)胞生長的，此時補液或半換液即可。

3.THP-1細(xì)胞有密度依賴性

THP-1細(xì)胞密度低時，生長較慢，培養(yǎng)密度維持在50萬-100萬細(xì)胞/毫升為宜;超過200萬/毫升則需要傳代。

4.THP-1細(xì)胞對血清要求高

血清質(zhì)量差異可能引起細(xì)胞狀態(tài)變化，建議選用高質(zhì)量的胎牛血清。選擇品質(zhì)好的血清更有利于THP-1細(xì)胞生長。

THP-1細(xì)胞培養(yǎng)方法及聚團處理方法

THP-1細(xì)胞培養(yǎng)實驗準(zhǔn)備

提前開啟紫外照射30min消毒滅菌，工作臺開燈通風(fēng)10min，用75%酒精擦拭臺面。

器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭、濾器、吸管、多孔培養(yǎng)皿、6cm皿、培養(yǎng)瓶等。

試劑：1640培養(yǎng)液、緩沖液、PBS、消化液、血清、抗生素、2-巰基乙醇。

THP-1細(xì)胞培養(yǎng)條件

THP-1細(xì)胞培養(yǎng)基：90% 1640+10% FBS+PS+ 0.05 mM 2-巰基乙醇(2-mercaptoethanol)

THP-1細(xì)胞傳代比例：1:2至1:3，每周 2-3次

THP-1細(xì)胞代次密度：如果THP-1細(xì)胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)

生長條件：氣相：95%空氣+5%二氧化碳;溫度：37℃

凍存條件：無血清凍存液(或者冷凍保存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配)，液氮儲存

消化時間：1-3min(視細(xì)胞情況而定)

THP-1細(xì)胞培養(yǎng)注意事項

THP-1屬于懸浮細(xì)胞，顯微鏡下可見細(xì)胞呈圓形，透明度高，背景干凈，碎片很少，說明細(xì)胞狀態(tài)很好。

2.THP-1常用RPMI 1640培養(yǎng)基，含10%胎牛血清，在37度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。特別注意的是THP-1喜歡酸性環(huán)境，對培養(yǎng)基pH值的變化很敏感，通常培養(yǎng)基顏色呈橘紅色時細(xì)胞最適宜生長。所以盡量使用相同Ph的1640。

3.THP-1細(xì)胞有密度依賴性，低密度時細(xì)胞生長慢，建議細(xì)胞量維持在每毫升50-100萬為宜，超過10^6/ml即可傳代，傳代比例采用1:3~1:4，換液不需要太頻繁，正常2~3天換1次液即可。

注意細(xì)胞的密度一定要高，介于5×105—— 106/ML之間，增值的快。細(xì)胞數(shù)量太少，不適合THP-1生長，一般狀態(tài)不好的THP-1在培養(yǎng)了3天后數(shù)量仍然不多，繼續(xù)培養(yǎng)一天或者兩天，培養(yǎng)基嚴(yán)重泛黃，細(xì)胞數(shù)會增加。這一點不同于同是單核細(xì)胞系的U937細(xì)胞。

4.傳代后切忌常移出培養(yǎng)箱觀察，否則會影響細(xì)胞生長，狀態(tài)變差，一般首先表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)顆粒變多。一般THP-1 生長相當(dāng)快，對于狀態(tài)已經(jīng)不好的情況，建議傳代后3～4天再觀察，一般4天時間培養(yǎng)基已明顯泛黃，細(xì)胞數(shù)量巨增

5.THP-1細(xì)胞培養(yǎng)時需要添加0.05mM的β-巰基乙醇。

6.THP-1細(xì)胞培養(yǎng)時可能會有部分細(xì)胞聚團生長，若細(xì)胞團塊過大過多，應(yīng)當(dāng)輕輕將其吹散。

THP-1細(xì)胞培養(yǎng)操作

THP-1細(xì)胞復(fù)蘇方法

1.將含有1 mLTHP-1細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍;

2.THP-1細(xì)胞在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1 mL 10%FBS 1640培養(yǎng)基后吹勻;

3.將所有THP-1細(xì)胞懸液加入6 cm皿中，加入約4 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜;

4.第二天檢查THP-1細(xì)胞密度。

THP-1細(xì)胞傳代步驟

如果THP-1細(xì)胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

方法一

收集THP-1細(xì)胞，1000RPM條件下離心3-5min分鐘，棄去上清液

補加1-2ml培養(yǎng)液后吹勻，將THP-1細(xì)胞懸液按1:2的比例分到新的含10ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

方法二

可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起

將THP-1細(xì)胞懸液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

備注：第一次傳代時，若培養(yǎng)基中有細(xì)胞碎片，則將細(xì)胞懸液裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻，按1:1分到新的裝有10mL新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

THP-1細(xì)胞凍存步驟

待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進行細(xì)胞凍存。下面10cm皿為例;

1.收集THP-1細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，加 1 mL新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進行細(xì)胞計數(shù)。

2.根據(jù)THP-1細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。

3.將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

THP-1細(xì)胞培養(yǎng)常見問題及解決方法

1.THP-1細(xì)胞凍存過后復(fù)蘇困難怎么辦?

a.凍存前細(xì)胞狀態(tài)較好, 凍存總量不低于1*106/支

b.復(fù)蘇后細(xì)胞接種密度建議3*106/ml

c.如有細(xì)胞碎片，待細(xì)胞密度增大后通過低速離心去除

2.THP-1細(xì)胞收貨時出現(xiàn)偽足，或是碎片較多怎么辦?

受到運輸影響，懸浮細(xì)胞會短暫性出現(xiàn)形態(tài)改變的現(xiàn)象，如偽足等。通過傳代培養(yǎng)，1周左右可以恢復(fù)正常。一些THP-1細(xì)胞在運輸途中死亡而產(chǎn)生碎片，通過傳代離心可以去除。

處理方法

收集THP-1細(xì)胞，1000RPM條件下離心3-5min分鐘，棄去上清液，補加1-2ml培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液重新分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.THP-1細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)胞發(fā)生貼壁怎么處理?

THP-1細(xì)胞培養(yǎng)過程中出現(xiàn)少量細(xì)胞貼壁屬于正常情況，不需要擔(dān)心?？梢暂p吹收集細(xì)胞或者丟棄貼壁部分細(xì)胞。

處理方法

只需將THP-1細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新瓶中即可。但如果當(dāng)貼壁細(xì)胞的比例高于20%，說明細(xì)胞生長環(huán)境有異常，這時候就需要排查培養(yǎng)箱設(shè)置、培養(yǎng)基成分，以及培養(yǎng)器皿是否異常。

4.THP-1細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)胞發(fā)生聚團怎么辦?

THP-1細(xì)胞培養(yǎng)過程中出現(xiàn)少量細(xì)胞聚團，呈葡萄串狀，屬于正?，F(xiàn)象，特別是THP-1細(xì)胞密度較低時，易出現(xiàn)這種情況。

處理方法

可以更換血清品牌或增大血清比例(不超過20%)有助于解決聚團問題。不建議將聚團的細(xì)胞吹散，等待密度高時，會自己分散開。

5.THP-1細(xì)胞培養(yǎng)基里一定要加β-巰基乙醇嗎?

β-巰基乙醇是一種常用的培養(yǎng)補充劑，有抗氧化的作用，可減少氧化應(yīng)激對THP-1細(xì)胞的影響。當(dāng)細(xì)胞密度過大但需要維持時，可適當(dāng)增加巰基乙醇的比例(不超過標(biāo)準(zhǔn)量的1.5倍)。

6.THP-1細(xì)胞鏡下觀察時，難以聚焦或估算密度怎么辦?

THP-1細(xì)胞形態(tài)特征懸浮生長，懸浮細(xì)胞會隨著液體流動，不容易聚焦，靜置5-10分鐘使細(xì)胞沉底，之后再輕輕放上顯微鏡觀察，將有助于聚焦和估算細(xì)胞密度。