小鼠胚胎成纖維細(xì)胞背景簡介

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞分離自胚胎；成纖維細(xì)胞(Fibroblast)是疏松結(jié)締組織的主要細(xì)胞成分，由胚胎時(shí)期的間充質(zhì)細(xì)胞分化而來。成纖維細(xì)胞較大，輪廓清楚，多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結(jié)構(gòu)，其細(xì)胞核呈規(guī)則的卵圓形，核仁大而明顯。成纖維細(xì)胞功能活動(dòng)旺盛，細(xì)胞質(zhì)嗜弱堿性，具明顯的蛋白質(zhì)合成和分泌活動(dòng)，在一定條件下，它可以實(shí)現(xiàn)跟纖維細(xì)胞的互相轉(zhuǎn)化；成纖維細(xì)胞對不同程度的細(xì)胞變性、壞死和組織缺損的修復(fù)有著十分重要的作用。剛分離的胚胎成纖維細(xì)胞呈圓形、折光性良好，懸浮于培養(yǎng)基中。30min細(xì)胞貼壁，其中部分開始伸出偽足，表現(xiàn)為小的突起；6h后細(xì)胞基本貼壁完全，伸展成梭形，胞核清晰，分布較均勻，散在生長，不聚集成團(tuán);細(xì)胞生長迅速，5-7天即呈融合狀態(tài)，細(xì)胞排列緊密，有的交叉重疊生長，平坦、胞體較大，細(xì)胞質(zhì)透明，細(xì)胞核較大，呈橢圓形，顏色淡。細(xì)胞融合，并彼此連接成網(wǎng)狀;細(xì)胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分布。細(xì)胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分布。

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞常用作ES細(xì)胞培養(yǎng)常用的飼養(yǎng)層細(xì)胞，能產(chǎn)生抑制ES細(xì)胞自主分化和促進(jìn)ES細(xì)胞增殖的因子，故能有效地促進(jìn)ES細(xì)胞的增殖并維持其未分化特性和多潛能性，且分泌效果優(yōu)于外源添加的一些因子，而且可以為ES細(xì)胞的培養(yǎng)提供類似于體內(nèi)的微環(huán)境，故在研究哺乳動(dòng)物ES細(xì)胞中得到廣泛使用。

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定方法視頻教程

主要試劑

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞專用培養(yǎng)基、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞組織分離液、PBS磷酸緩沖液、眼科剪、鑷子、玻璃平皿、75%酒精

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)操作過程

1. 配鼠：每天18:00-19:00時(shí)將雌、雄小鼠按3:1比例合籠。第2天8:00時(shí)分籠，并觀察雌性小鼠有無陰栓，有陰栓確定為懷孕，記0.5 d，并分開單獨(dú)飼養(yǎng)。

2. 取孕13.5 d小鼠,斷頸處死，置于體積分?jǐn)?shù)為75%酒精消毒3 min。無菌打開孕鼠腹腔，可見腹腔兩側(cè)呈“V”字型串珠樣子宮，用鑷子提起子宮(不能碰到皮毛，以防污染)，并用眼科剪去除子宮系膜和結(jié)締組織，剝離子宮。將子宮放入含有PBS的一次性無菌培養(yǎng)皿中，漂洗兩三遍，去除淤血。

3. 用眼科剪和鑷子去除胎盤、羊膜等胚胎外組織，取出胚胎放入另一平皿，用PBS洗滌，直到?jīng)]有血跡為止。

4. 用眼科剪和鑷子去除胚胎的頭部、四肢及內(nèi)臟，留取軀干部 (注:頭部、四肢及內(nèi)臟需去除干凈)，將軀干部放入玻璃平皿中，用PBS洗滌1次

5. 用眼科剪將胚胎軀干部剪碎成糊狀，加入5 mL PBS混勻移入離心管中，自然沉降3 min后，將上清液輕輕吸出棄掉。

6. 加入3 mL 組織分離液輕輕吹打后室溫下自然沉降2 min，將上清液輕輕吸出棄掉。

7. 加入3 mL 組織分離液輕輕吹打后室溫下消化3 min，將上部的單細(xì)胞懸液輕輕吸出放入另一離心管中，加等量小鼠胚胎成纖維細(xì)胞專用培養(yǎng)基終止消化，重復(fù)消化兩次。若還有未消化的組織，再加入3 mL 組織分離液輕輕吹打至完全消化，終止消化。

8. 混勻離心管收集所有細(xì)胞懸液，自然沉降1 min，將大塊沉淀吸出棄掉。

9. 800 r/min離心5 min，棄上清，使用重懸至5 mL。計(jì)數(shù)，按5x106/瓶接種到T25培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足體積分?jǐn)?shù)為小鼠胚胎成纖維細(xì)胞專用培養(yǎng)基，記為原代(PO)。37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，

10.24小時(shí)后，換液以去未貼壁的細(xì)胞及碎片，細(xì)胞融合至80%-90%時(shí)，消化，按 1∶3-1∶4 比例傳代培養(yǎng)

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞鑒定

1. 形態(tài)鑒定

剛分離的胚胎成纖維細(xì)胞呈圓形、折光性良好，懸浮于培養(yǎng)基中。30min細(xì)胞貼壁，其中部分開始伸出偽足，表現(xiàn)為小的突起;6h后細(xì)胞基本貼壁完全，伸展成梭形，胞核清晰，分布較均勻，散在生長，不聚集成團(tuán);細(xì)胞生長迅速，5-7天即呈融合狀態(tài)，細(xì)胞排列緊密，有的交叉重疊生長，平坦、胞體較大，細(xì)胞質(zhì)透明，細(xì)胞核較大，呈橢圓形，顏色淡。細(xì)胞融合，并彼此連接成網(wǎng)狀;細(xì)胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分布。細(xì)胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分布。

2. 標(biāo)志物鑒定

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞經(jīng)Vimentin免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上

3. 飼養(yǎng)層制備

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層制備

人胚胎干細(xì)胞傳代前1 d制備飼養(yǎng)層細(xì)胞

1.0.1%明膠水溶液加入培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶底部包被培養(yǎng)瓶，置37 ℃培養(yǎng)箱孵育2 h后備用。

2.取細(xì)胞融合率約90%的第2-4代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，棄原培養(yǎng)液，將2 mL含10 mg/L絲裂霉素C及體積分?jǐn)?shù)為小鼠胚胎成纖維細(xì)胞專用培養(yǎng)基加入培養(yǎng)瓶，置37 ℃培養(yǎng)2 h。

3.棄絲裂霉素C，用PBS洗5次，每次2 min (動(dòng)作要輕柔，以免細(xì)胞層脫落，必要時(shí)可在鏡下觀察細(xì)胞層有無脫落)。

4.加入0.25%胰酶2 mL消化，加入等體積的含體積分?jǐn)?shù)為小鼠胚胎成纖維細(xì)胞專用培養(yǎng)基中止消化，并用吸管輕輕吹打瓶底，使細(xì)胞脫壁。

5.收集消化細(xì)胞，800 r/min離心5 min，棄上清，加含體積分?jǐn)?shù)為小鼠胚胎成纖維細(xì)胞專用培養(yǎng)基重懸，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

6.取出經(jīng)明膠包被培養(yǎng)瓶，棄去明膠水溶液，以5.0×105個(gè)/瓶接種細(xì)胞，含體積分?jǐn)?shù)為小鼠胚胎成纖維細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)，備用。使用前需換用胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液。