CHO細(xì)胞又稱(chēng)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinese Hamster Ovary)，1957年美國(guó)科羅拉多大學(xué)Dr. Theodore T. Puck從一成年雌性倉(cāng)鼠卵巢分離獲得，是一種來(lái)源于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢的上皮細(xì)胞系。

CHO細(xì)胞簡(jiǎn)介

CHO細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞，是一種非分泌型細(xì)胞，它本身很少分泌CHO內(nèi)源蛋白，因此對(duì)目標(biāo)蛋白分離純化工作十分有利?？尚纬捎谢钚缘亩垠w(如白介素2)，具有糖基化的功能(如EPO), CHO為表達(dá)復(fù)雜生物大分子的理想宿主。該細(xì)胞存在遺傳缺陷，無(wú)脯氨酸合成基因，不能將谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼?半醛，培養(yǎng)過(guò)程中需在培養(yǎng)基中添加L-脯氨酸才能生長(zhǎng)。并且由于該細(xì)胞已經(jīng)霍亂毒素適應(yīng)，形態(tài)學(xué)有所改變。最初細(xì)胞為貼壁型細(xì)胞，經(jīng)多次傳代篩選后，也可懸浮生長(zhǎng)。

歷史及種類(lèi)

CHO細(xì)胞最早由Puck實(shí)驗(yàn)室在1957年分離，通過(guò)將0.1g中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢組織酶解消化獲得。酶解后大部分細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞，在進(jìn)行超過(guò)10個(gè)月的體外培養(yǎng)后，細(xì)胞并未表現(xiàn)出普通二倍體細(xì)胞的Hayflick界限，仍然可以繼續(xù)分裂生長(zhǎng)，但是細(xì)胞形態(tài)從最初的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變成近上皮細(xì)胞的形態(tài)。1958年P(guān)uke實(shí)驗(yàn)室將此連續(xù)傳代細(xì)胞進(jìn)行重新克隆后，建立了我們現(xiàn)在所用的CHO細(xì)胞最原始細(xì)胞系。

這個(gè)最原始的CHO細(xì)胞系是脯氨酸缺陷型的，必須在培養(yǎng)基中添加額外的脯氨酸以支持其生長(zhǎng)，目前所有已知的CHO細(xì)胞系均保留了這個(gè)特性。這個(gè)最原始的CHO細(xì)胞系后來(lái)流轉(zhuǎn)到不同的實(shí)驗(yàn)室和公司，經(jīng)過(guò)不同的培養(yǎng)、馴化、改造和重新克隆后形成了不同種類(lèi)的CHO細(xì)胞系。這些細(xì)胞系雖然都是來(lái)源于最原始的CHO細(xì)胞系，但由于CHO細(xì)胞基因組內(nèi)在的不穩(wěn)定性及后續(xù)不同實(shí)驗(yàn)室的篩選培養(yǎng)條件不同，不同CHO細(xì)胞系之間的形態(tài)、生長(zhǎng)、表達(dá)、代謝、甚至基因組都有較大差異，下面就幾種常用的CHO細(xì)胞系進(jìn)行描述。

CHO-K1

CHO-K1是未經(jīng)改造的野生型CHO細(xì)胞。最初的CHO-K1是在1970年左右，由Puck和Kao的實(shí)驗(yàn)室將原始CHO細(xì)胞系的一個(gè)亞克隆存放于ATCC(CCL-61)，并命名。隨后源于ATCC CHO-K1的一個(gè)亞克隆在1985年被分離，并保存于ECACC(85051005)，并被制藥公司和CMO公司用作重組蛋白的表達(dá)。最原始的CHO-K1細(xì)胞是貼壁培養(yǎng)，并需要添加血清，由于血清的批間穩(wěn)定性問(wèn)題，及后來(lái)病毒安全性問(wèn)題，無(wú)血清懸浮培養(yǎng)成為趨勢(shì)。其中Lonza公司從ECACC獲得CHO-K1馴化到懸浮無(wú)血清培養(yǎng)后，建立CHO K1 SV(Lonza，2002)細(xì)胞株，并廣泛應(yīng)用于其GS表達(dá)平臺(tái)。Merck(原SAFC)也是從ECACC獲得CHO-K1細(xì)胞株，并懸浮馴化至化學(xué)成分限定培養(yǎng)基中，形成了CHOZN? CHO K1(Merck，2006)細(xì)胞株。

基于CHO-K1細(xì)胞的表達(dá)平臺(tái)多采用GS(谷氨酰胺合成酶)篩選系統(tǒng)和/或抗生素篩選系統(tǒng)。采用GS篩選系統(tǒng)的平臺(tái)可在轉(zhuǎn)入目的蛋白基因的同時(shí)轉(zhuǎn)入GS基因，在篩選階段采用不含谷氨酰胺的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。但由于CHO-K1細(xì)胞具有內(nèi)源的GS基因，因此在篩選時(shí)往往需要添加MSX甚至和一定量的抗生素同時(shí)篩選，以提高篩選效率。此外，由于內(nèi)源GS基因的存在，篩選出的高表達(dá)克隆往往穩(wěn)定性較差，需要進(jìn)行充分的穩(wěn)定性評(píng)估后，方可用于后期的工藝開(kāi)發(fā)及規(guī)?；a(chǎn)。而單獨(dú)采用抗生素進(jìn)行篩選的平臺(tái)，因篩選效率較低，多用于研究階段。目前多個(gè)已經(jīng)上市的治療性蛋白是基于CHO-K1細(xì)胞進(jìn)行開(kāi)發(fā)生產(chǎn)的。

CHO-S

基于原始的CHO細(xì)胞系，1973年Thompson實(shí)驗(yàn)室分離了一株可用于懸浮培養(yǎng)的CHO細(xì)胞，并將此細(xì)胞命名為CHO-S。雖然都來(lái)源于最原始的CHO細(xì)胞系，但從細(xì)胞歷史分枝上看，CHO-S和CHO-K1分屬于不同的代系。此細(xì)胞系在1980年代后期提供給當(dāng)時(shí)的Gibco公司，后者將此細(xì)胞馴化至CD CHO培養(yǎng)基中，建庫(kù)并以CHO-S名稱(chēng)進(jìn)行推廣。因其能在無(wú)血清培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)，并支持高密度培養(yǎng)，在早期常被用作瞬時(shí)表達(dá)宿主細(xì)胞。此后，相應(yīng)的GMP細(xì)胞庫(kù)被建立，并支持商業(yè)化授權(quán)開(kāi)發(fā)。

CHO-DXB11

CHO-DXB11(又名DUK-XB11)是由哥倫比亞大學(xué)的Urlaub和Chasin在1970-80年代通過(guò)伽馬射線(xiàn)誘變的方法獲得。CHO-DXB11細(xì)胞的雙等位基因中，一個(gè)DHFR基因被敲除，另一個(gè)DHFR基因僅包含一個(gè)錯(cuò)義突變(T137R)，這使得此細(xì)胞不能有效還原葉酸而合成次黃嘌呤(H)和胸苷(T)。在表達(dá)外源重組蛋白時(shí)，將外源的DHFR基因和目標(biāo)蛋白基因同時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并通過(guò)缺乏HT的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。由于DHFR基因可以通過(guò)重組重排進(jìn)行基因擴(kuò)增，在適當(dāng)?shù)腗TX壓力下，可以通過(guò)DHFR基因的擴(kuò)增同時(shí)獲得目標(biāo)蛋白基因的擴(kuò)增，從而獲得更高表達(dá)的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。在早期CHO細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)通常需要加入血清，因此在當(dāng)時(shí)的細(xì)胞篩選protocol里面經(jīng)常會(huì)看到用透析血清來(lái)避免引入HT或其它核酸代謝底物。此外需要指出的是，CHO細(xì)胞平臺(tái)上第一個(gè)被批準(zhǔn)上市的tPA就是采用DXB11做為宿主細(xì)胞，并且此宿主細(xì)胞被Genentech用于后續(xù)的多個(gè)商業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)。

CHO-DG44

由于DXB11細(xì)胞中僅有一個(gè)等位基因被敲除，在長(zhǎng)期傳代過(guò)程中，會(huì)發(fā)生低幾率的突變使宿主細(xì)胞重新恢復(fù)DHFR基因活性，造成篩選壓力的下降甚至導(dǎo)致重組蛋白表達(dá)量的下降。因此，獲得一個(gè)雙等位DHFR基因完全敲除的宿主細(xì)胞成為一個(gè)需求。Chasin實(shí)驗(yàn)室先后通過(guò)化學(xué)誘變和伽馬射線(xiàn)誘變，最終在1983年篩選出了雙等位DHFR基因敲除的CHO宿主細(xì)胞，并命名為CHO-DG44。雖然和DXB11都屬于DHFR基因缺陷型，但從譜系分枝來(lái)看，DG44和CHO-S更為接近。因?yàn)镈G44細(xì)胞完全缺失了DHFR基因的活性，并且可以無(wú)血清懸浮培養(yǎng)，使得篩選和加壓過(guò)程變得更加有效。目前多家公司及CDMO企業(yè)采用此細(xì)胞做為平臺(tái)進(jìn)行治療性蛋白的開(kāi)發(fā)，已經(jīng)有多個(gè)產(chǎn)品進(jìn)入臨床及上市階段。

CHOK1SV GS-KO

Lonza在其CHOK1SV細(xì)胞的基礎(chǔ)上，與Cellectis 合作并利用后者的Meganucleases技術(shù)將CHOK1SV細(xì)胞中GS的雙等位基因完全敲除，于2012年推出了CHOK1SV GS-KO細(xì)胞株。由于內(nèi)源性的GS基因被完全敲除，大大提高了篩選效率，縮短了穩(wěn)定細(xì)胞株的開(kāi)發(fā)周期(相比CHOK1SV系統(tǒng)縮短了6周)，同時(shí)提升了最終克隆的穩(wěn)定性?；贕S-KO細(xì)胞的GS Xceed表達(dá)平臺(tái)除包括宿主細(xì)胞株外，還包括相應(yīng)的質(zhì)粒及V8培養(yǎng)基系統(tǒng)。GS Xceed已經(jīng)在全球用于多個(gè)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)，并向全球授權(quán)(Lonza一代CHOK1SV不給中國(guó)授權(quán))。但由于V8培養(yǎng)基系統(tǒng)相對(duì)復(fù)雜，多數(shù)CHOK1SV/GS-KO客戶(hù)并未采用其培養(yǎng)基系統(tǒng)。

CHOZN GS

Merck(原SAFC)于2006年通過(guò)ECACC獲得CHO-K1細(xì)胞株，并將其馴化至化學(xué)成分限定培養(yǎng)基CD Fusion中，然后進(jìn)行亞克隆建立CHOZN CHO K1細(xì)胞系。在此細(xì)胞系基礎(chǔ)上，通過(guò)ZFN(鋅指核酸酶)技術(shù)敲除GS雙等位基因，獲得GS缺陷型細(xì)胞株CHOZN GS，并于2012年推向市場(chǎng)。整個(gè)平臺(tái)除細(xì)胞株外，還包括質(zhì)粒、克隆構(gòu)建階段用的培養(yǎng)基及流加工藝平臺(tái)培養(yǎng)基。通過(guò)平臺(tái)化的培養(yǎng)工藝進(jìn)行細(xì)胞篩選，可將穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建及上游工藝開(kāi)發(fā)周期縮減到18個(gè)星期。目前以CHOZN GS做為宿主細(xì)胞的多個(gè)項(xiàng)目已經(jīng)在全球多個(gè)國(guó)家推進(jìn)到臨床實(shí)驗(yàn)階段。

Others

除了上述在工業(yè)界應(yīng)用較多的細(xì)胞系外 ，還有其他一些CHO細(xì)胞系也在應(yīng)用。

如在歐洲應(yīng)用比較多的Selexis公司SURE CHO-M細(xì)胞株，其源于ECACC CHO-K1細(xì)胞系，并經(jīng)馴化后獲得，Selexis表達(dá)平臺(tái)同時(shí)運(yùn)用MARs元件來(lái)提升篩選效率和目標(biāo)蛋白表達(dá)量，運(yùn)用CHO-M的多個(gè)項(xiàng)目已經(jīng)推進(jìn)到臨床實(shí)驗(yàn)階段并有一個(gè)分子獲得批準(zhǔn)上市。

Horizon的HD-BIOP1(GS Null CHO-K1)也是源于ECACC CHO-K1細(xì)胞系，通過(guò)rAAV技術(shù)將雙等位GS基因敲除，獲得GS缺陷型細(xì)胞，但由于基因編輯實(shí)驗(yàn)過(guò)程中部分實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵材料記錄不全而引起監(jiān)管機(jī)構(gòu)的擔(dān)心，Horizon試圖通過(guò)全基因組測(cè)序來(lái)消除監(jiān)管機(jī)構(gòu)的擔(dān)心，但由于基因組數(shù)據(jù)過(guò)于龐大以及現(xiàn)在對(duì)整個(gè)基因組數(shù)據(jù)的解讀尚需時(shí)日，目前為止尚未在歐美國(guó)家獲得臨床實(shí)驗(yàn)批準(zhǔn)。

CHO細(xì)胞特性

CHO細(xì)胞雖可像微生物細(xì)胞一樣，在人工控制條件的生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，但其細(xì)胞結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性與微生物細(xì)胞相比，有顯著差別；動(dòng)物細(xì)胞比微生 物細(xì)胞大得多，無(wú)細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，對(duì)剪切力敏感，適應(yīng)環(huán)境能力差;倍增時(shí)間長(zhǎng)，生長(zhǎng)緩慢，易受微生物污染，培養(yǎng)時(shí)須用抗生素;培養(yǎng)過(guò)程需氧量少;培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞相互粘連以集群形式存在，原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖50代即退化死亡;代謝產(chǎn)物具有生物活性，生產(chǎn)成本高，但附加值也高

CHO細(xì)胞結(jié)構(gòu)

具有不死性，可傳百代以上，是生物工程廣泛使用的細(xì)胞系

屬于成纖維細(xì)胞，可貼壁培養(yǎng)，經(jīng)多次傳代篩選后也可懸浮培養(yǎng)

一種非分泌細(xì)胞，本身很少分泌內(nèi)源蛋白，因此對(duì)目標(biāo)蛋白分離純化十分有利

形成有活性二聚體，具有糖基化功能，是表達(dá)復(fù)雜生物大分子的理想宿

CHO細(xì)胞培養(yǎng)

可在人工控制條件的生物反應(yīng)器中大規(guī)模培養(yǎng)

比微生物細(xì)胞更大，無(wú)細(xì)胞壁,機(jī)械強(qiáng)度較低，對(duì)剪切力敏感，環(huán)境適應(yīng)能力差

配增時(shí)間長(zhǎng)，生長(zhǎng)緩慢，易受微生物污染

培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞相互粘連以集群形式存在

培養(yǎng)過(guò)程需氧量少，代謝產(chǎn)物具有生物活性，生產(chǎn)成本

CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)

具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能，表達(dá)的糖基化藥物蛋白分子在分子結(jié)構(gòu).理化特性和生物學(xué)功能更接近天然蛋白分子

具有產(chǎn)物胞外分越功能，便于下游產(chǎn)物分離純化

具有重組基因的高效擴(kuò)增和表達(dá)能力

具有貼壁生長(zhǎng)特性，可以進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，具有較高的表達(dá)能

CHO細(xì)胞的一些問(wèn)題

構(gòu)建重組CHO細(xì)胞生產(chǎn)效率低，產(chǎn)物濃度也低

某些糖基化表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定，不方便純化

重組細(xì)胞上游構(gòu)建與下游分離純化脫節(jié),主要表現(xiàn)在，上游高效表達(dá)與下游有效提取之間的矛盾

重組細(xì)胞培養(yǎng)費(fèi)用昂貴，自動(dòng)化水平低

CHO細(xì)胞展望

隨著以CHO細(xì)胞為主的動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)日益完善,動(dòng)物細(xì)胞將成為基因工程藥物的主要宿主細(xì)胞.研發(fā)人員將對(duì)以下問(wèn)題進(jìn)行主要研究

1.提高表達(dá)水平，如發(fā)展些新的強(qiáng)啟動(dòng) 子，裝配適合于高效表達(dá)的必要元件

2.在提高表達(dá)的同時(shí),注重下游分離純化，如改變中的個(gè)別序列，使表達(dá)產(chǎn)物在不影響生物活性的前提下攜帶有利于分離純化的基團(tuán)

3.細(xì)胞培養(yǎng)成本的控制，高密度高產(chǎn)量和培養(yǎng)設(shè)備的大型化自動(dòng)化和精竅化

4.分離純化的低成本和高活性回收率

參考資料

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2. Hauser, H. and R. Wagner (2014). Animal Cell Biotechnology: In Biologics Production

3. Fischer, S., R. Handrick and K. Otte (2015). 'The art of CHO cell engineering: A comprehensive retrospect and future perspectives.' Biotechnol Adv 33(8): 1878-1896.