MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞成骨誘導(dǎo)引言

MC3T3-E1subclone 14細(xì)胞株是從克隆的但是表型各異的MC3T3-E1細(xì)胞系中分離出一系列亞克隆。 從含抗壞血酸培養(yǎng)基生長(zhǎng)的成骨細(xì)胞中選擇高或低成骨細(xì)胞分化、礦化的亞克隆。 MC3T3亞克隆4(ATCC CRL-2593)和MC3T3亞克隆14(ATCC CRL-2594)在抗壞血酸和3到4mM無(wú)機(jī)磷酸鹽中生長(zhǎng)表現(xiàn)出高水平的成骨細(xì)胞分化。 它們10天后形成一個(gè)礦化良好的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)。

MC3T3亞克隆24(ATCC CRL-2595)和MC3T3亞克隆30(ATCC CRL-2596)在抗壞血酸中生長(zhǎng)表現(xiàn)出很差的成骨細(xì)胞分化。 不形成ECM， 可以作為亞克隆4和14的陰性對(duì)照。 礦化的亞克隆選擇的表達(dá)作為成骨細(xì)胞標(biāo)記的mRNA，及唾液酸糖蛋白(BSP)，骨鈣素(OCN)，和甲狀旁腺激素/甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白受體的mRNA。

高或者低的分化潛能的亞克隆在培養(yǎng)中生產(chǎn)出相似數(shù)量的膠原質(zhì)，表達(dá)可比較的基本水平的mRNA編碼Osf2/Cbfa1，一種成骨細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。 植入免疫缺陷小鼠以后，高分化性的亞克隆形成與骨類似的形成小骨的編織骨，低分化細(xì)胞只是產(chǎn)生纖維組織。 這些細(xì)胞系是研究體外成骨細(xì)胞分化的好模型，尤其是ECM信號(hào)。 它們和原代培養(yǎng)顱頂成骨細(xì)胞的行為類似。

MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

MC3T3-E1 Subclone 14小鼠顱頂前骨細(xì)胞亞克隆14細(xì)胞

MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)步驟(以12孔板為例)

1.MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞正常培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)到80%~90%時(shí)，即可用胰酶消化，計(jì)數(shù);；

2.按2~3×104 cells/cm2的細(xì)胞密度接種在12孔板中(具體接板數(shù)量以實(shí)際預(yù)實(shí)驗(yàn)情況為準(zhǔn))，每孔加入1 mL的MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞完全培養(yǎng)基；

3.將接種好的MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；

4.誘導(dǎo)試劑配置：MC3T3-E1 Subclone 14成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清和添加物三部分組成，使用前將各組分混勻后即可得到成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基；

5.當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%~95%時(shí)，小心的將孔內(nèi)完全培養(yǎng)基吸走，向12孔板中加入1 mL預(yù)熱的MC3T3-E1 Subclone 14成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基；

6.每隔48~72h更換預(yù)熱的新鮮的成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基；

7.誘導(dǎo)培養(yǎng)2~4周，期間注意觀察細(xì)胞形態(tài)變化。根據(jù)細(xì)胞鈣質(zhì)結(jié)節(jié)形成的情況，決定是否進(jìn)行下一步染色鑒定。

MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞誘導(dǎo)分化結(jié)果展示

MC3T3-E1 Subclone 14誘導(dǎo)過程中注意事項(xiàng)

開始誘導(dǎo)時(shí)的細(xì)胞密度可控制在90%~95%，注意避免細(xì)胞過飽和導(dǎo)致細(xì)胞卷邊漂起或者狀態(tài)不佳。

實(shí)驗(yàn)開始前確保細(xì)胞狀態(tài)，盡可能使用早代次的細(xì)胞開始實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞鋪板需均勻，鋪板不均勻可能導(dǎo)致分化不均勻、分化比例低、分化過程中細(xì)胞漂浮等問題。

由于誘導(dǎo)時(shí)間較長(zhǎng)，為防止細(xì)胞脫落，可提前使用明膠包被培養(yǎng)板。

細(xì)胞換液或者添加誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基時(shí)需注意：誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基提前37℃復(fù)溫；換液時(shí)可留一點(diǎn)原液作為緩沖，加液時(shí)槍頭沿壁逐滴加入，操作應(yīng)迅速，盡量避免在超凈臺(tái)內(nèi)操作時(shí)間過長(zhǎng)，同時(shí)手法要輕柔;這樣對(duì)細(xì)胞的沖擊最小，否則極易導(dǎo)致細(xì)胞卷邊飄起。

避免長(zhǎng)時(shí)間將細(xì)胞拿出培養(yǎng)箱外進(jìn)行觀察，并盡量減少培養(yǎng)板的晃動(dòng)，以防細(xì)胞卷邊或漂浮。

拍照時(shí)可留少量PBS，減少光圈的出現(xiàn)，以便呈現(xiàn)更好的拍攝效果。