產品簡介

B-27 Serum-Free Supplement (50×)，即 B-27 無血清添加劑(50×)，B-27 是一種最常被引用的神經細胞培養(yǎng)添加劑，是一種優(yōu)化的無血清添加劑，用于支持胚胎、出生后和成年海馬神經元和其他中樞神經系統(tǒng)(CNS)神經元的生長和活性維持。B-27 無血清添加劑以 50 倍工作液提供，旨在與神經基底培養(yǎng)基一起使用，神經基底培養(yǎng)基用于神經細胞培養(yǎng)，無需星形膠質細胞飼養(yǎng)層。在神經元基礎培養(yǎng)基中使用 B-27 添加劑，用于培養(yǎng)產前和胚胎神經元，以獲得優(yōu)化的活性和長期的存活率。

在神經元基礎培養(yǎng)基中使用 B-27 添加劑，用于培養(yǎng)神經來源的腫瘤細胞系，可有效地保證其活性。在 DMEM/F12 培養(yǎng)基中添加 B-27 添加劑，已被證明可支持擴增來自小鼠胚胎紋狀體和中腦的 EGF響應性的前體細胞。

本產品配方中去除了維生素 A，以防止神經干細胞向神經細胞分化。

產品信息

B-27無血清添加劑 50X 不含維生素_AB-27 Serum-Free Supplement 使用說明

1.完全培養(yǎng)基制備 

(1)置于 4℃解凍本產品。

(2)在使用前無菌添加 2%本產品和 0.5 mM L-谷氨酰胺至神經元基礎培養(yǎng)基，配制成神經元完全培養(yǎng)基(注：下文中出現的“神經元完全培養(yǎng)基”即指此種添加了 B-27 添加劑和 L-谷氨酰胺的神經元基礎培養(yǎng)基)注意：剩余的本產品可以等分成工作體積，并儲存在-30~-5℃。在以后的試驗中根據需要解凍相應體積的本產品。避免反復凍融。

(3)對于原代海馬神經元培養(yǎng)，神經元完全培養(yǎng)基(由前述步驟制備)需要額外補充 25μM 的 L-谷氨酸，在培養(yǎng)的第 4 天以后的換液中應不再添加谷氨酸。配置好的完全培養(yǎng)基，可于 2-8℃的避光保存一周。

2.細胞培養(yǎng)步驟

下列步驟已在大鼠胎兒原代海馬和皮層神經元，以及神經母細胞瘤細胞系中測試。

(1)用無菌的冷的 0.05 mg/mL 多聚賴氨酸水溶液包被培養(yǎng)表面(玻璃或細胞培養(yǎng)級塑料)，每平方厘米表面使用 0.15 mL，在室溫下保溫 1h。

(2)去除多聚賴氨酸溶液，并用無菌蒸餾水沖洗兩次(須徹底清洗，因為多聚賴氨酸對細胞有毒性)。在超凈工作臺中打開培養(yǎng)板的蓋子通風，直到每個孔都完全干燥。培養(yǎng)板干燥后可以立即使用或在 4℃最多保存 2 周。

(3)根據標準實驗室程序或隨細胞提供的說明書分離原代的大鼠神經元或解凍凍存的原代大鼠神經元。

(4)在預熱的(37℃)神經元完全培養(yǎng)基中(如前所述的方法制備)接種細胞，建議的細胞密度為 160個細胞/mm2，或必要時使用自行優(yōu)化的細胞密度。注意：對于海馬神經元，培養(yǎng)基中須添加 25μML-谷氨酸，參見“完全培養(yǎng)基的制備”。

(5)在 36℃至 38℃，含 5%二氧化碳的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)(使用自然空氣也是可接受的，但推薦含 9%氧氣和 5%二氧化碳的氣體環(huán)境)。

(6)培養(yǎng) 4-24 小時后，更換一半體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(7)對海馬神經元以外的細胞：在接種 4 天后，更換一半體積的新鮮的完全培養(yǎng)基，之后每三天重復一次。對海馬神經元：接種三天后，用不含 L-谷氨酸的新鮮培養(yǎng)基更換一半體積的培養(yǎng)基。之后每三天重復一次。注意：在完全培養(yǎng)基中添加 25 μM 2-巰基乙醇，可改善海馬神經元的長期存活率。

3.分離原代大鼠胚胎神經元

下列程序推薦用于培養(yǎng)受精 18 天的大鼠胚胎海馬神經元和大腦皮層神經元。

(1)從受精 18 天的大鼠胚胎中分離大腦皮層和雙側海馬。

(2)在預置了 Hibernate-E 完全培養(yǎng)基的錐形管中收集所有的組織。放置，直到所有的組織都已解體。

(3)使組織沉積在管的底部，然后小心地去除上清液，只留下剛好可覆蓋組織的最少量的培養(yǎng)基。

(4)在不含鈣離子的 Hibernate-E 培養(yǎng)基中，使用 2 mg/mL 過濾滅菌的木瓜蛋白酶溶液，在 30℃酶解組織大約 30 min，其間每 5 min 輕搖錐形管以幫助降解。每對海馬組織使用 2 mL 酶溶液。

(5)加入兩倍體積的 Hibernate-E 完全培養(yǎng)基以恢復二價陽離子的濃度，停止酶解。

(6)使未解離的組織沉降至管底(約 2 min)，然后把上清液轉移到 15 mL 離心管中，以 150×g 離心5 min。

(7)在 1 mL 神經元完全培養(yǎng)基中重懸沉淀物，取一小份(例如 10μL)進行細胞計數。后續(xù)的操作按照“復蘇和培養(yǎng)凍存的神經元”的第 8-10 步驟進行。

4.復蘇和培養(yǎng)凍存的神經元

重要提示：原代神經元細胞將會貼附在裸露的塑料或玻璃表面，建議事先用神經元完全培養(yǎng)基沖洗所有的塑料和玻璃器皿的內表面，以獲得最高的回收率和產量。由于細胞從凍存狀態(tài)復蘇時極其脆弱，請在整個操作過程中不要震蕩或離心細胞。我們建議每次只解凍一管細胞。務必減少從液氮中轉移凍存管到 37℃水浴中的操作時間。細胞從液氮罐到水浴的運輸過程中，可在冰桶中放少量液氮，將細胞置于這個冰桶中來進行。

(1)在解凍細胞之前，用神經元完全培養(yǎng)基沖洗無菌的 15 mL 錐形管，然后在超凈工作臺中通風晾干。

(2)從液氮中取出凍存管時可稍微擰松管帽以釋放壓力，然后再擰緊。

(3)在 37℃水浴中輕柔攪拌凍存管以快速解凍細胞(小于 2 min)。當觀察到凍存管中只有很少量的冰晶存在時(觸摸凍存管仍然感覺是冷的)從水浴中取出。

(4)在超凈工作臺中用 70%的異丙醇消毒凍存管。在工作臺臺面上輕敲凍存管以使管內液體沉降到管底。

(5)使用事先用神經元完全培養(yǎng)基沖洗并干燥過的 1 mL 吸頭極其輕柔地將細胞轉移到事先沖洗并干燥的 15 mL 錐形管中。

(6)用 1 mL 預熱的神經元完全培養(yǎng)基沖洗沖洗凍存管，以每秒一滴的速度極其緩慢地加入到 15 mL錐形管中的細胞里。每加一滴都輕柔地轉動錐形管一次。不要一次即把全部培養(yǎng)基加到錐形管中。

(7)慢慢地逐滴加入另外 2 mL 預熱的完全培養(yǎng)基，使管內的液體體積為 4 mL。用 1 mL 吸頭輕柔地混合液體，注意不要造成任何氣泡。

(8)用一個事先沖洗干燥過的吸頭吸取 10μ

B-27無血清添加劑 50X 不含維生素_AB-27 Serum-Free Supplement 注意事項

1.本產品經過嚴格除菌過濾，為無菌產品，必須在超凈臺內使用，以避免微生物污染。

2.本產品須盡量避免光照。本產品充分融解并混勻后，如有必要，可以適當分裝后-20℃避光保存。短期內如果頻繁使用，可以 4℃避光保存，并建議在 1-2 周內用完。

3.本產品長時間存放可能會出現少量沉淀，可上下顛倒混勻，完全溶解后即可正常使用。

4.本產品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。

5.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。