一、產(chǎn)品介紹

hESC/iPSC 細(xì)胞培養(yǎng)基試劑盒是一種適用于無飼養(yǎng)層培養(yǎng)，成分明確，補(bǔ)充多種生長因子的人多能干細(xì)胞（hPSC）無血清培養(yǎng)體系。hESC/iPSC 在 hESC/iPSC 細(xì)胞培養(yǎng)基中可以快速增殖，而邊緣分化的細(xì)胞則在該培養(yǎng)基中生長較慢，從而選擇性擴(kuò)增并獲得高純度人多能干細(xì)胞。

二、產(chǎn)品信息

表 1： hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基 試劑盒產(chǎn)品內(nèi)容

產(chǎn)品信息	貨號	規(guī)格	儲存條件
hESC/iPSC 細(xì)胞培養(yǎng)基試劑盒	IMC-014	1 Kit	2℃～-20℃
hESC/iPSC Basal Medium	IMC -014-M	400mL	2℃～8℃
hESC/iPSC Grouth SupplementsA	IMC-014-A	20mL	-20℃ or -80℃
hESC/iPSC Grouth Supplements B	IMC-014-B	80mL	-20℃ or -80℃
hESC/iPSC Supplement C	IMC-014-Y	1mL	-20℃ or -80℃

三、 試劑準(zhǔn)備

1 ）hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基配制（500 mL ）

1. 在 4℃條件下解凍 hESC/iPSC Grouth SupplementsA/B，勿在 37℃培養(yǎng)箱/水浴鍋解凍。

2. 參考表 表 3 在生物安全柜中，使用無菌移液管混勻下列成分配制成 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基，之后置于 4℃儲存，封口膜封好后 2 周內(nèi)使用。

3. 有初培養(yǎng)需擴(kuò)建的需求，建議先配置 100 mL,保證 2 周內(nèi)使用完畢。

表 3：hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基配置說明*

組分	500 mL	100 mL	50 mL
hESC/iPSC Basal Medium	400 mL	80 mL	40 mL
hESC/iPSC Grouth SupplementsA	20 mL	4 mL	2℃～8℃
hESC/iPSC Grouth Supplements B	80 mL	16 mL	8 mL

可根據(jù)實際用量將 hESC/iPSC Grouth Supplements A/B 分裝后冷凍保存。具體配置比例可參考表 3 的配置說明。hESC/iPSC Grouth Supplements A/B 凍融總次數(shù)不能超過 2 次。

2 ）Matrigel 鋪板（以貨號為 354277 的 的 Corning? Matrigel? 包被 6 孔板為例 ）

A. 裝 分裝 Matrigel

1. 貨號 354277 的 Matrigel，操作說明中不標(biāo)注蛋白濃度，而是以 Dilution Factor 表示，如某批次的推薦 Dilution Factor 為 278 μL，則表明 278 μL 可包被 4 塊 6 孔板，分裝數(shù)量=5 mL/0.278=17.98。

2. 準(zhǔn)備 18 個無菌 1.5 mL EP 管，標(biāo)記 Matrigel 日期、操作人；1mL 無菌吸頭；EP 管架，均置于-20℃冰箱中預(yù)冷 1 小時。

3. 將 Matrigel 放置 4℃冰箱過夜解凍，當(dāng) Matrigel 完全解凍即可開始分裝。

注：在解凍時，將 Matrigel 放置冰箱內(nèi)側(cè)角落，切勿放在靠近冰箱門附近。

4. 準(zhǔn)備一個裝滿碎冰的冰盒，將解凍過的 Matrigel、預(yù)冷的 1.5 mL EP 管及 EP 管架、1mL吸頭放置于生物安全柜上。

5. 混勻 Matrigel，無菌分裝于各個 1.5 mL EP 管中，并置于冰上。當(dāng)吸頭被堵塞可能導(dǎo)致分裝體積不準(zhǔn)時需要更換吸頭。

6. 將分裝后的 Matrigel 置于-20℃冰箱中保存。

B. 鋪板

1. 取 36 mL 冷藏 DMEM/F12 于 50 mL 離心管中，準(zhǔn)備 4 個 6 孔板，標(biāo)記 Matrigel、批號、日期和操作人。

2. 1 mL 無菌吸頭置于-20℃冰箱中預(yù)冷 1 小時，取出一支冷凍的 Matrigel（5mL）置于 4℃冰箱解凍至完全化凍。

3. 準(zhǔn)備一個裝滿碎冰的冰盒，將解凍過的 Matrigel、預(yù)冷的 1mL 吸頭放置于生物安全柜上。

4. 用預(yù)冷的吸頭向解凍過的 Matrigel（5mL），加入 1 mL 冷的 DMEM/F12 反復(fù)吹打解凍并混勻。

5. 吸出已解凍混勻的 Matrigel 加入離心管中剩余的 DMEM/F12，使用 10 mL 移液管再次反復(fù)吹打混勻。

6. 分裝 1.5 mL/孔于 4 個六孔板中，輕輕搖晃混勻。

7. 培養(yǎng)板置于室溫 1 小時后即可使用，或置于 4℃冷藏過夜，兩周內(nèi)使用。

四、 復(fù)蘇 hESC/iPSC （以 6 孔板為例）

1. 將水浴鍋預(yù)熱至 37℃。

2. 將 Matrigel 包被的 6 孔板，提前放置生物安全柜中約 1 小時恢復(fù)至室溫（15~30℃）。

3. 取 4 mL hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基，按照 1:4000 比例加入 1 μL 的 hESC/iPSC Supplement C，恢復(fù)至室溫（15~30℃）。

TIPS：不要在 37℃水浴鍋中預(yù)溫培養(yǎng)基。

4. 取出 1 支冷凍的細(xì)胞置于 37℃水浴鍋手持輕輕搖晃，2 min 內(nèi)解凍，肉眼觀察細(xì)胞懸液內(nèi)冰晶即將完全消失時取出。

5. 75%酒精無塵紙擦拭凍存管表面，轉(zhuǎn)入生物安全柜；將細(xì)胞懸液移到事先準(zhǔn)備好的 15 mL離心管中，隨后逐滴加入 10mL DMEM/F12，過程中輕柔晃動混勻細(xì)胞，160 g 離心 5 min。

6. 吸棄上清，加入預(yù)溫的 4 mL 的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基混勻細(xì)胞，盡量避免吹打。

注：可留 20 μL 上清液，輕彈管底，使細(xì)胞懸浮液更均勻，避免成較大細(xì)胞團(tuán)。

7. 吸除 6 孔板中 2 孔的 Matrigel 包被液，將混勻的細(xì)胞按照 2 mL/孔接種到 2 孔中。

8. 水平十字搖勻三次，置于 37℃，5% CO 2 濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中，再次水平十字搖勻三次培養(yǎng)。

9. 18-24 小時后換新的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基，之后每天更換培養(yǎng)基。

注：在 hESC 培養(yǎng)過程中，如果細(xì)胞的匯合度超過 50%，建議更換培養(yǎng)基時，培養(yǎng)基的體積增加至 3-4mL/孔。

表 4： hESC/iPSC 傳代&培養(yǎng)操作試劑推薦用量

五 、傳代 hESC/iPSC （以 6 孔板為例）

1. 傳代條件：① 細(xì)胞匯合度達(dá) 85%左右（如圖 1(C-D)所示），一般情況下每 3-4 天傳代；

② 細(xì)胞匯合度較低，生長密度分布不均勻。

注：即使克隆團(tuán)較小、匯合度不足，也建議不要連續(xù)培養(yǎng)超過 5 天。

2. 傳代比例：可根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)和實驗需要按 1:5~1:12 的比例進(jìn)行傳代，如果細(xì)胞正常，克隆團(tuán)匯合度 85%，大小均勻（如圖 1(C-D)所示），建議按照 1:8 進(jìn)行傳代，如果密度偏低，則可降低傳代比例；密度偏高，則增加傳代比例。

注：1:8 傳代就是 1 個孔瓶傳 8 個孔（以 6 孔板為例）。

3. 將 Matrigel 包被的 6 孔板，提前放置生物安全柜中約 1 小時恢復(fù)至室溫（~25℃）。

4. 根據(jù)傳代接種的孔數(shù)準(zhǔn)備 2 mL/孔的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基，并按 1：4000 比例加入hESC/iPSC Supplement C( IMC-014-Y） ，恢復(fù)至室溫（~25℃）。

圖 1.hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng) hESC 細(xì)胞形態(tài)圖 ：（A ）和（C ） 分別為 hESC 細(xì)胞培養(yǎng)第 2 和 4

天時 低倍鏡 hESC 培養(yǎng) 形態(tài)圖示， （B ）和（D ） 為培養(yǎng)至第 2 和 和 4 天時的 高倍鏡 hESC 培養(yǎng) 形態(tài)圖。

5. 將 Matrigel 包被的 6 孔板，提前放置生物安全柜中約 1 小時恢復(fù)至室溫（~25℃）。

6. 根據(jù)傳代接種的孔數(shù)準(zhǔn)備 2 mL/孔的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基，并按 1：4000 比例加入hESC/iPSC Supplement C，恢復(fù)至室溫（~25℃）。

7. 將孔內(nèi)培養(yǎng)基吸取，加入 2 mL/孔的 DPBS（不含鈣鎂），輕輕搖晃并吸取。

8. 加入 2 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution 使溶液完全覆蓋孔底。

9. 置于 37℃培養(yǎng)箱中孵育 8-9 min。

注：① 消化 8-9 min 后鏡下觀察細(xì)胞變化，當(dāng)大部分細(xì)胞變亮變圓，且細(xì)胞尚未脫離基質(zhì)或漂起時即可終止消化，若大部分細(xì)胞仍未變亮，則需要延長消化時間；

② 保持 6 孔板與培養(yǎng)箱金屬隔板直接接觸，使 6 孔板受熱均勻，不要疊放。10. 消化結(jié)束后輕輕地將細(xì)胞培養(yǎng)板拿回生物安全柜，避免震蕩搖晃細(xì)胞，傾斜并吸除hESC/iPSC Passage Solution。

11. 及時加入 2 mL/孔預(yù)溫的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基+ hESC/iPSC Supplement C，水平十字搖晃 6 孔板使細(xì)胞脫離基質(zhì)。

注：① 加 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基+ hESC/iPSC Supplement C 時，可輕柔吹打細(xì)胞 1-2 次，不能超過 2 次，避免反復(fù)吹打；有部分細(xì)胞（10%～15%）未脫離基質(zhì)是正?，F(xiàn)象，若有大量細(xì)胞未脫離則需延長消化時間（< 10min）。

② hESC 不能長時間處于 hESC/iPSC Passage Solution（<15 min），所以收集接種細(xì)胞時操作必須快速,以及最好一次操作不要超過 4 孔（六孔板）。

圖 2 ： 消化 hESC 細(xì)胞不同時間 形態(tài)圖 ： （A ） 消化 8 min 低倍鏡 hESC 培養(yǎng)的 的形態(tài)圖; （B ） 消化 9 min

低倍鏡 hESC 培養(yǎng)的 的形態(tài)圖。

12. 吸取 6 孔板中的 Matrigel 溶液，加入預(yù)溫的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基+ hESC/iPSC Supplement C 2 mL/孔。

13. 在 6 孔板上標(biāo)記細(xì)胞名稱、代次、傳代比例、日期、操作人。將步驟 9 獲得的細(xì)胞懸液輕輕搖勻，按預(yù)先設(shè)定的傳代比例均勻分配于孔板中。

注：為了鋪板均勻并降低對細(xì)胞的損傷，可以將步驟 9 獲得的細(xì)胞懸液收集至 2 mL 離心管，輕柔顛倒混勻細(xì)胞 1-2 次；再按照傳代比例接種。

14. 接種后，水平十字搖勻 6 孔板三次，置于 37℃，5% CO 2 濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中， 再次水平十字搖勻 6 孔板三次，培養(yǎng)過夜。

15. 18-24 小時后更換新 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基，此后每天換液，4-5 天后繼續(xù)傳代/凍存。

六、凍存 hESC/iPSC

1. 當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá) 85%左右（如圖 1(C-D)所示）可收獲凍存，一般 6 孔板每孔可凍存 1 管。

2. 準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量的 1.5/2 mL 凍存管，標(biāo)記細(xì)胞名稱、代次（P#）、日期、操作人。

3. 取出 4℃冰箱中的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，置于室溫預(yù)溫，使用前注意 搖勻。

4. 吸取上清液，加入 2 mL/孔的 DPBS（不含鈣鎂），輕輕搖晃數(shù)次，再吸取。

5. 加入 2 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution，將細(xì)胞置于 37℃培養(yǎng)箱中，計時 8-9 min（可

參考“ 六、傳代 hESC/iPSC”步驟）。

6. 消化結(jié)束，輕輕取出培養(yǎng)板，吸取 hESC/iPSC Passage Solution。

7. 搖勻預(yù)溫的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，每孔加入 1 mL 凍存液，輕柔吹打，水平十字搖勻 3 次，隨后吸取細(xì)胞懸液加入 1.5/2 mL 凍存管中。

8. 將細(xì)胞置于梯度程序降溫盒中，并置-80℃冰箱中過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮罐中長期保存。

七、其他培養(yǎng)體系中 hESC/iPSC 更換為 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基條件的適應(yīng)

其他無飼養(yǎng)層條件培養(yǎng)的 hESC/iPSC 可以在細(xì)胞狀態(tài)良好時，使用原培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞傳代，24 小時后更換成混合培養(yǎng)基（原培養(yǎng)基與 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基按照 1:1 混合）培養(yǎng)，培養(yǎng) 2 代后完全換成 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng) 2-3 代后可完全適應(yīng)新的培養(yǎng)體系，此時可進(jìn)行細(xì)胞凍存處理。

八、問題及解決方案

1.hESC/iPSC 培養(yǎng)出現(xiàn)分化

確保 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基儲存于4℃，并在2周內(nèi)用完，每次只預(yù)溫當(dāng)次實驗所需的培養(yǎng)基，減少其溫度變化，避免培養(yǎng)基中的因子效價下降。

如hESC/iPSC克隆整體形態(tài)良好，零星分化細(xì)胞(<1%)出現(xiàn)于克隆周邊，可以通過hESC/iPSC PassageSolution 去除。

確保傳代hESC/iPSC的細(xì)胞團(tuán)大小均勻，約20個細(xì)胞左右的團(tuán)塊為佳;若細(xì)胞團(tuán)較大，可用5mL移液管輕柔 吹打不超過3次，力度要輕且均勻，否則細(xì)胞受壓過大易產(chǎn)生破損、分化。

每次觀察時避免將細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出超過15min。

若hESC/iPSC克隆表現(xiàn)為內(nèi)部松散，邊緣不平滑，分化比例超過20%，則建議廢棄。

2.能否用Dispase或膠原酶傳代hESC/iPSC

可以用 Dispase或膠原酶傳代，但細(xì)胞消化不會太好，影響傳代后細(xì)胞的存活率，也容易積存分化的細(xì)胞。

hESC/iPSC完全培養(yǎng)基體系中的hESC/iPSC建議使用非酶的溫和的消化方式傳代。

如果實驗需要將hESC/iPSC消化成單細(xì)胞，建議使用Accutase酶消化5-10 分鐘。

3.hESC/iPSC傳代后不貼壁或貼壁率低

傳代比例不要過高(>1:12)。

hESC/iPSC Passage Solution消化時間不宜過長，部分可能需要延長消化時間超過9min，不要超過15 min。

避免過度吹打細(xì)胞(<2 次)，以免細(xì)胞團(tuán)被吹散，或?qū)?xì)胞造成損傷。

確保培養(yǎng)板已包被Matrigel或其他適合多能干細(xì)胞生長的基質(zhì)成分。

確保培養(yǎng)基中加入了hESC/iPSC Supplement C。

4.換液后細(xì)胞漂起

接種后 18-24小時后進(jìn)行第一次換液，確保細(xì)胞已貼壁良好。

換液操作要輕柔，避免使細(xì)胞團(tuán)脫離基質(zhì)。

5.孔內(nèi) hESC/iPSC 克隆團(tuán)分布不均勻

確保包被的基質(zhì)均勻地分布于容器底部。

傳代接種時確保細(xì)胞分散均勻，水平十字搖勻后避免晃動培養(yǎng)板導(dǎo)致細(xì)胞聚集于孔的中間部分。

再把培養(yǎng)板放置入培養(yǎng)箱時，需再次水平十字搖勻。