產(chǎn)品介紹

干細(xì)胞傳代無酶工作液（hESC/ iPSC Passage Solution）適用于無滋養(yǎng)層依賴的干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)，具有溫和，高效，使用普遍的特點(diǎn)。

hESC/iPSC傳代工作液使用

1. 傳代條件：① 細(xì)胞匯合度達(dá) 85%左右（如圖 1(C-D)所示），一般情況下每 3-4 天傳代；

② 細(xì)胞匯合度較低，生長密度分布不均勻。

注：即使克隆團(tuán)較小、匯合度不足，也建議不要連續(xù)培養(yǎng)超過 5 天。

2. 傳代比例：可根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)和實(shí)驗(yàn)需要按 1:5~1:12 的比例進(jìn)行傳代，如果細(xì)胞正常，克隆團(tuán)匯合度 85%，大小均勻（如圖 1(C-D)所示），建議按照 1:8 進(jìn)行傳代，如果密度偏低，則可降低傳代比例；密度偏高，則增加傳代比例。

注：1:8 傳代就是 1 個(gè)孔瓶傳 8 個(gè)孔（以 6 孔板為例）。

3. 將 Matrigel 包被的 6 孔板，提前放置生物安全柜中約 1 小時(shí)恢復(fù)至室溫（~25℃）。

4. 根據(jù)傳代接種的孔數(shù)準(zhǔn)備 2 mL/孔的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基，并按 1：4000 比例加入hESC/iPSC Supplement C( IMC-014-Y） ，恢復(fù)至室溫（~25℃）。

圖 1.hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng) hESC 細(xì)胞形態(tài)圖 ：（A ）和（C ） 分別為 hESC 細(xì)胞培養(yǎng)第 2 和 4

天時(shí) 低倍鏡 hESC 培養(yǎng) 形態(tài)圖示， （B ）和（D ） 為培養(yǎng)至第 2 和 和 4 天時(shí)的 高倍鏡 hESC 培養(yǎng) 形態(tài)圖。

5. 將 Matrigel 包被的 6 孔板，提前放置生物安全柜中約 1 小時(shí)恢復(fù)至室溫（~25℃）。

6. 根據(jù)傳代接種的孔數(shù)準(zhǔn)備 2 mL/孔的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基，并按 1：4000 比例加入hESC/iPSC Supplement C，恢復(fù)至室溫（~25℃）。

7. 將孔內(nèi)培養(yǎng)基吸取，加入 2 mL/孔的 DPBS（不含鈣鎂），輕輕搖晃并吸取。

8. 加入 2 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution 使溶液完全覆蓋孔底。

9. 置于 37℃培養(yǎng)箱中孵育 8-9 min。

注：① 消化 8-9 min 后鏡下觀察細(xì)胞變化，當(dāng)大部分細(xì)胞變亮變圓，且細(xì)胞尚未脫離基質(zhì)或漂起時(shí)即可終止消化，若大部分細(xì)胞仍未變亮，則需要延長消化時(shí)間；

② 保持 6 孔板與培養(yǎng)箱金屬隔板直接接觸，使 6 孔板受熱均勻，不要疊放。10. 消化結(jié)束后輕輕地將細(xì)胞培養(yǎng)板拿回生物安全柜，避免震蕩搖晃細(xì)胞，傾斜并吸除hESC/iPSC Passage Solution。

11. 及時(shí)加入 2 mL/孔預(yù)溫的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基+ hESC/iPSC Supplement C，水平十字搖晃 6 孔板使細(xì)胞脫離基質(zhì)。

注：① 加 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基+ hESC/iPSC Supplement C 時(shí)，可輕柔吹打細(xì)胞 1-2 次，不能超過 2 次，避免反復(fù)吹打；有部分細(xì)胞（10%～15%）未脫離基質(zhì)是正?，F(xiàn)象，若有大量細(xì)胞未脫離則需延長消化時(shí)間（< 10min）。

② hESC 不能長時(shí)間處于 hESC/iPSC Passage Solution（<15 min），所以收集接種細(xì)胞時(shí)操作必須快速,以及最好一次操作不要超過 4 孔（六孔板）。

圖 2 ： 消化 hESC 細(xì)胞不同時(shí)間 形態(tài)圖 ： （A ） 消化 8 min 低倍鏡 hESC 培養(yǎng)的 的形態(tài)圖; （B ） 消化 9 min

低倍鏡 hESC 培養(yǎng)的 的形態(tài)圖。

12. 吸取 6 孔板中的 Matrigel 溶液，加入預(yù)溫的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基+ hESC/iPSC Supplement C 2 mL/孔。

13. 在 6 孔板上標(biāo)記細(xì)胞名稱、代次、傳代比例、日期、操作人。將步驟 9 獲得的細(xì)胞懸液輕輕搖勻，按預(yù)先設(shè)定的傳代比例均勻分配于孔板中。

注：為了鋪板均勻并降低對細(xì)胞的損傷，可以將步驟 9 獲得的細(xì)胞懸液收集至 2 mL 離心管，輕柔顛倒混勻細(xì)胞 1-2 次；再按照傳代比例接種。

14. 接種后，水平十字搖勻 6 孔板三次，置于 37℃，5% CO 2 濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中， 再次水平十字搖勻 6 孔板三次，培養(yǎng)過夜。

15. 18-24 小時(shí)后更換新 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基，此后每天換液，4-5 天后繼續(xù)傳代/凍存。