細(xì)胞永生化技術(shù)服務(wù)

研究背景

正常組織來源的細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下可分裂生長，但經(jīng)過有限次數(shù)的傳代后，就會停止增殖，發(fā)生衰老和死亡，這種現(xiàn)象稱之為海弗利克極限。有的細(xì)胞自發(fā)或受外界因素的影響，可以從增殖衰老危機(jī)中逃離，從而擁有無限增殖的能力，該過程稱之為細(xì)胞永生化。然而自發(fā)永生化的幾率非常小，嚙齒類動物為10-5-10-6， 而人類細(xì)胞則更為罕見， 小于10-12。通過轉(zhuǎn)染技術(shù)將外源性永生化基因?qū)肽康募?xì)胞或誘導(dǎo)衰老相關(guān)基因突變，可以增加永生化的發(fā)生率，從而建立穩(wěn)定的永生化細(xì)胞株。

技術(shù)簡介

細(xì)胞永生化(Cell immortalization)是指體外培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)過自發(fā)的或受外界因素的影響從增殖衰老危機(jī)中逃離，從而具有增殖能力的過程。正常組織來源的細(xì)胞在通常的體外培養(yǎng)條件下可分裂生長，但經(jīng)過有限次數(shù)的傳代后，就會停止增殖，發(fā)生衰老和死亡。利用基因轉(zhuǎn)染等技術(shù)將外源性永生化基因?qū)肽康募?xì)胞內(nèi)，從而建立永生化細(xì)胞株，以達(dá)到使體外培養(yǎng)的細(xì)胞具有增殖能力且細(xì)胞間無差異的目的。對細(xì)胞永生化進(jìn)行深入研究，不只是有利于我們了解細(xì)胞增殖與衰老的分子機(jī)制，而且為探尋腫瘤治療及器官移植的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。此外，由于永生化細(xì)胞具有可以多次傳代的特性，可以利用各種細(xì)胞永生化的方法使那些傳代困難、增殖緩慢、容易衰老的細(xì)胞獲得永生，從而為研究人員提供許多的細(xì)胞資源，為科學(xué)研究提供了良好的體外細(xì)胞模型。

哺乳動物細(xì)胞使用幾種方法誘導(dǎo)細(xì)胞永生化。其中猿猴病毒40(SV40)T抗原和hTERT病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞永生化最為簡單可靠，應(yīng)用廣泛。

為什么要做細(xì)胞永生化

許多細(xì)胞永生化技術(shù)可以在體外為細(xì)胞系提供擴(kuò)展的增殖能力，同時(shí)密切模擬體內(nèi)細(xì)胞的生理學(xué)。與原代細(xì)胞不同，永生化細(xì)胞不易受復(fù)制衰老的影響，減少了重新購買和重新啟動生長的需要，節(jié)省了時(shí)間和費(fèi)用。

? 定制永生化服務(wù)產(chǎn)生的細(xì)胞系壽命更長，通常與原代親本細(xì)胞相似

? 細(xì)胞永生化服務(wù)相結(jié)合，能夠克服原代細(xì)胞有限的壽命

? 除了標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞認(rèn)證測試，可以測試永生化細(xì)胞系的擴(kuò)展增殖能力和從感興趣的組織中選擇表型標(biāo)記(例如，hTERT的持續(xù)表達(dá))

永生化細(xì)胞具有增殖能力，并具有與親本組織相似或相同的基因型和表型，能夠提供穩(wěn)定均一、性狀一致的細(xì)胞來源，其意義主要包括但不限于

了解細(xì)胞生長規(guī)律，探索細(xì)胞衰老機(jī)制;

體外研究細(xì)胞增殖、分化、調(diào)亡等的理想模型;

有助于明確致癌物質(zhì)的作用機(jī)制;

體內(nèi)外探究腫瘤發(fā)生機(jī)制的重要模型;

為研究者提供更多且更豐富的細(xì)胞資源等。

操作流程

服務(wù)內(nèi)容

原代細(xì)胞分離純化

永生化基因的慢病毒制備

慢病毒感染原代細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)

永生化混合細(xì)胞進(jìn)行抗生素篩選

永生化細(xì)胞系進(jìn)行端粒酶基因表達(dá)和衰老檢測

服務(wù)流程

客戶提供：原代細(xì)胞、干細(xì)胞、免疫細(xì)胞材料，您可以提供自主分離的特定原代細(xì)胞，也可以從我們的原代細(xì)胞產(chǎn)品中選擇合適的目的細(xì)胞。

我們提供：建立永生化細(xì)胞株，以及提供建立方法，步驟及結(jié)果。

也可提供表型和功能的驗(yàn)證：永生化細(xì)胞系可以根據(jù)您的要求進(jìn)行表型和功能的驗(yàn)證， 包括mRNA表達(dá)，蛋白質(zhì)表達(dá)或功能測定。

周期：4-8 周

報(bào)價(jià)：15000 元/株

公司優(yōu)勢

團(tuán)隊(duì)擁有成套完善的技術(shù)體系，進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建

制備的永生化細(xì)胞系純度高，無污染

提供完整并準(zhǔn)確的鑒定方案，鑒定報(bào)告真實(shí)可靠

擁有低成本、高效率的制備模式，極大縮短生產(chǎn)周期

項(xiàng)目案例

細(xì)胞永生化方法

細(xì)胞永生化的機(jī)制主要包括：理化因素作用所致的原癌基因活化/抑癌基因失活;端粒酶的穩(wěn)定活化;具有致瘤性的病毒如SV40病毒、EB病毒、人乳頭狀瘤病毒HPV等。

一般而言，自發(fā)永生化的幾率非常小，因此基于細(xì)胞永生化的機(jī)制，常通過轉(zhuǎn)染技術(shù)人為地將外源性永生化基因?qū)肽康募?xì)胞，或?qū)σ职┗蜻M(jìn)行敲除，或誘導(dǎo)永生化相關(guān)基因突變以增加永生化的發(fā)生率，從而建立穩(wěn)定的永生化細(xì)胞株。

病毒基因轉(zhuǎn)染

很多病毒感染能夠誘導(dǎo)細(xì)胞永生化，例如EB病毒(epstein-barr virus, EBV)、猿猴病毒40 (simian virus40, SV40)和人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)。這些病毒感染其天然宿主細(xì)胞，能誘導(dǎo)細(xì)胞永生化。

EBV能使B淋巴母細(xì)胞永生化形成淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系，它是通過潛伏蛋白激活細(xì)胞因子與其受體相互作用的途徑使細(xì)胞永生的。EBV永生化B細(xì)胞的一個(gè)最顯著的特點(diǎn)是端粒酶活性的提高，這可能是導(dǎo)致B細(xì)胞永生的主要原因。目前，EB病毒介導(dǎo)的細(xì)胞永生化應(yīng)用最多的是B淋巴細(xì)胞，其他細(xì)胞中的應(yīng)用很少。

SV40是簡單的真核細(xì)胞病毒，SV40的T抗原片段是最常用的目的片段，將其整合入靶細(xì)胞核內(nèi)并表達(dá)，可導(dǎo)致細(xì)胞增殖活力的改變并表現(xiàn)出多種與腫瘤相關(guān)的轉(zhuǎn)化顯型。應(yīng)用的方法包括：野生型SV40病毒共培養(yǎng)感染靶細(xì)胞、磷酸鈣法、電穿孔以及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法等。

HPV已成功將人的包皮細(xì)胞、角化上皮以及乳腺、胰導(dǎo)管和口腔等的上皮細(xì)胞永生化。HPV病毒的早期表達(dá)蛋白E6和E7在細(xì)胞永生化中起決定性作用。E6和E7蛋白能夠改變細(xì)胞的終末分化，誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入S期，使細(xì)胞繞過正常細(xì)胞的周期檢查點(diǎn)。

病毒法獲得的永生化細(xì)胞往往發(fā)生細(xì)胞表型改變，而且一般只應(yīng)用于病毒 的特定宿主細(xì)胞。由于該法將整個(gè)病毒基因組導(dǎo)入了細(xì)胞，因此，很容易使細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞。

端粒酶激活

端粒酶是一種能延長端粒末端的核糖核蛋白酶，由RNA和蛋白質(zhì)組成。端粒酶能以自身的RNA為模板，從端粒DNA3’-OH 末端延伸端?；蚝铣尚碌亩肆NA， 以補(bǔ)償細(xì)胞分裂時(shí)染色體末端的縮短，從而維持端粒的長度，使細(xì)胞不會因端粒耗盡而出現(xiàn)凋亡。正常情況下，大多數(shù)體細(xì)胞端粒酶的表達(dá)是嚴(yán)格調(diào)控的，表達(dá)是瞬時(shí)和低水平的。在原代培養(yǎng)的細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)人端粒酶催化亞基(hTERT)基因能穩(wěn)定端粒的長度，使細(xì)胞易于永生化，因此hTERT的激活是細(xì)胞永生化的重要步驟。雖然激活端粒酶活性能夠使多種人和動物的細(xì)胞永生化，但是對于有些細(xì)胞，重建端粒酶活性并不足以使細(xì)胞永生化，還需要借助癌基因法。

癌基因法

一些原癌基因，如Myc, c-Jun, c-Ias, vsrc和Mdm2，通過基因轉(zhuǎn)染可介導(dǎo)目的細(xì)胞永生化。c-Myc是最早被發(fā)現(xiàn)的原癌基因，有許多與瘤化相關(guān)的功能區(qū)域，其轉(zhuǎn)錄表達(dá)的蛋白通過核膜進(jìn)入細(xì)胞核與端粒酶的啟動子結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合，誘導(dǎo)端粒酶mRNA快速表達(dá)，直接激活端粒酶活性，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入永生化。

細(xì)胞永生化過程中，抑癌基因如p53, pRb, BRCA1, DPC4等，通過等位基因隱性作用、抑癌基因的顯性負(fù)作用等逐漸失去活性，細(xì)胞老化途徑受阻。實(shí)驗(yàn)證明端粒酶的活性與抑癌基因表達(dá)產(chǎn)物的下調(diào)有相關(guān)關(guān)系，推測抑癌基因的失活協(xié)同端粒酶的激活共同參與細(xì)胞永生化進(jìn)程。

目前有多種細(xì)胞永生化的方法，但不是每一種方法都可使一個(gè)特定的細(xì)胞 永生化。由于細(xì)胞的來源動物、組織不同，其細(xì)胞的增殖、分化調(diào)控也不盡相同，因此，每類細(xì)胞的永生化的分子機(jī)制不同，其永生化細(xì)胞的方法也不同。

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